Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Bu prosedürün genel amacı, bir farede in vivo kalvaryal defekt modeli kullanarak osteojenik diferansiyasyon amacıyla adipöz dokudan multipotent stromal hücreleri toplamaktır. Bu işlem, öncelikle liposuction prosedürü sonrası elde edilebilen adipöz dokunun stromal vasküler tabakasından progenitör hücrelerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, üç boyutlu bir iskelet hazırlamak ve ardından hücreleri bu iskale ekmektir.

Son adım, iskele ve hücrelerin yerleştirileceği bir sıçan modelinde kritik boyutlu bir kalvarial defekt oluşturulmasıdır. Nihayetinde sonuçlar, adipoz dokudan izole edilen multipotent stromal hücrelerin in vivo iskelet rejenerasyonu potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. İskelet rejenerasyonu için mevcut doku yetersizliği nedeniyle, bu tekniğin uygulamaları geniş bir klinik uygulama spektrumuna sahiptir.

Otojen kemik greftleri altın standart olsa da, donör bölge eksikliği ve donör bölge morbiditesi bu seçeneği sınırlamaktadır. Allogreftler ve yabancı materyaller kullanılabilmektedir ancak bunlar maliyet, zayıf entegrasyon ve potansiyel enfeksiyon riskleri nedeniyle sınırlıdır.

Skeletal doku mühendisliği için progenitor hücrelerin izolasyonunda adipoz veya yağ dokusunun olası kullanımı heyecan vericidir. Prosedürü, long anchor laboratuvarından ben ve Michael Chungle göstereceğiz. İlk olarak, elektif lipo aspirasyon işlemlerinden insan subkutan adipoz dokusu elde edin.

Lipoaspirattaki iki tabakayı fark edin. Üst faz, hücresel materyalin büyük çoğunluğunu içerir. Alt tabaka ise çoğunlukla enjekte edilen salindir.

Adipoz kaynaklı stromal hücreler her iki katmandan da toplanabilir, ancak verim süpernatanttan çok daha yüksektir. Stromal vasküler fraksiyonu veya SVF'yi izole etmek için, lipo aspiratı önce eşit hacimlerde bir x fosfat tamponlu salin veya %2,5 Betadine içeren PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayın, ardından Betadine içermeyen bir x PBS ile eşit hacimde aspiratla tekrar yıkayın. Yıkama işleminin çökelmesine izin verin.

İşlenmiş insan dokusu ile kontaminasyonu önlemek için işlem boyunca steril tekniği koruduğunuzdan emin olun. Ardından, her yıkamadan sonra alt tabakayı aspire edin ve atın, sonra 15 mililitre adipoz dokuyu 50 mililitrelik Falcon konik tüplere aktarın. Daha sonra adipoz dokuyu 15 mililitre filtrelenmiş %0,075'lik filtre ile digeste edin.

Tip iki kollajenazı, Hank dengeli tuz çözeltisi veya HBSS içinde, 37 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda, sabit ajitasyon altında 60 dakika boyunca inkübe edin; tüpleri her 15 dakikada bir havalandırmayı unutmayın. Ardından, enzim aktivitesini %10 fetal bovin serum veya FBS içeren 15 mL PBS ile nötralize edin ve santrifüjleyin. Yüksek yoğunluklu bir SVF peleti elde etmek için; pelet, adipoz kaynaklı kök hücreler ve eritrositlerin bir karışımı olacaktır.

Önce üstteki yağ tabakasını, ardından pellet'i bozmadan üstteki sıvı tabakasını uzaklaştırın. Pellet'i 10 mililitre geleneksel büyüme medyumunda yeniden süspande edin. Daha sonra üç tüpü, 100 mikronluk bir filtre aracılığıyla tek bir temiz 50 mililitrelik konik tüpte birleştirin ve santrifüjleyin.

Çökelti yerinden oynamadan süpernatantı uzaklaştırın ve ardından çökeltiyi yeniden süspande edin. Beş mililitrelik geleneksel büyüme ortamında, her bir 10 santimetrelik plaka için iki adet 50 mililitrelik konik tüp veya bir adet 15 santimetrelik plaka için beş adet beş mililitrelik konik tüp birleştirin. Birincil kültürleri 37 °C'de, %21 oksijen ve %5 karbondioksit altında gece boyunca oluşturun.

Gece boyu inkübasyondan sonra, yapışmamış kalıntı eritrositleri uzaklaştırmak için plakaları PBS ile yıkayın. Ortaya çıkan hücre popülasyonları adipoz kaynaklı stromal hücrelerdir. Spontan diferansiyasyonu önlemek için hücreleri sub-konflüen seviyelerde tutun.

37 °C, %21 oksijen ve %5 karbondioksit koşullarında. Büyüme ortamında, hücrelerin genellikle her üç ila dört günde bir standart büyüme ortamında pasajlanması gerekir. %50 konfluens düzeyinde ekildiklerinde, iskeleyi ekteki makalede açıklandığı şekilde hazırlayın.

Hücreler sub-konflüans seviyelerine ulaştığında, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve tripsinize edin. Hücre miktarını belirlemek için sayım yapın. Ekim işlemi için, önceden kesilmiş 4 mm çapındaki iskelelere 1,5 x 10⁵ hücre ekmeye hazırlanın.

96 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna tek bir iskela yerleştirin, ardından hücreleri, 20 µL besiyeri başına yaklaşık 1,5 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda standart büyüme besiyeri ile yeniden süspande edin. 20 µL çözeltiyi doğrudan iskelanın içine pipetleyerek ekim yapın ve bunu 30 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöründe bekletin.

30 dakika sonra, 200 µL medya ekleyin ve hücrelerin iskele üzerinde gece boyunca inkübe edilmesine izin verin. Cerrahi işlem öncesinde, ekim aşamasındaki gibi hücrelerin iskeleye yapıştığından emin olmaya gerek yoktur. Yeterli sayıda hücre, çoğunluğunun iskeleye tutunmasını sağlayacaktır.

60 günlük yetişkin bir CD one nude fare anestezi edildikten sonra, cerrahi bölgeyi üç kez Betadine ve alkol ile sterilize edin ve farelerin gözlerine kayganlaştırıcı sürün. Ardından, sağ paryetal kemiği açığa çıkarmak için farenin kafa derisinde orta hat boyunca sagittal bir insizyon yapın. Periostu, sağ paryetal kemikten künt sıyırma yöntemiyle temizleyin.

Ardından, sağ non-sütür ilişkili parietal kemikte tek taraflı dört milimetrelik tam kat bir defekt oluşturun. Fare kalvaryum kalınlığı implantasyon öncesinde 0,3 mm'den az olduğu için, elmas kaplı dişli matkap ucu kullanırken alttaki dura mater'e zarar vermemeye son derece dikkat edin. Besiyeri kaynaklı büyüme faktörlerinin transferini önlemek için iskeleleri steril PBS ile durulayın.

İskele yapısını defekt bölgesine yerleştirin. Son olarak, cildi sütürle kapatın ve hayvanı belirlenmiş postoperatif protokollere göre izleyin. Fareye mikro CT uygulayın ve microview yazılımını kullanarak 3D yeniden yapılandırılmış bir görüntü elde edin.

Görüntüleri standart bir yüksekliğe getirmek için Adobe Photoshop kullanın. Genellikle, kafa tası rejenerasyonu için her iki haftada bir ölçüm yaparız. Fareler, uzun süreli takip için tarama sırasında anestezi altına alınır ve nihayetinde itlaf edilirler.

Histolojik analiz için, kalvaryum defektinin piksellerini ölçmek amacıyla sihirli değnek özelliğini kullanın. Defektin iyileşme yüzdesini sonraki BT taramaları ile belirleyin. Kalvaryum defekt alanını ölçüp piksel sayısını belirleyin ve bu sayıyı orijinal defektin piksel sayısına bölün; osteo oluşumu belirtmek için annal in blue ve pen aro gibi histolojik boyalar kullanarak defekt boyunca birden fazla kesiti boyayın.

Kafatası defekti dışında kalan tüm alanları kırpmak için Adobe Photoshop'u kullanın ve defekt alanındaki de novo kemik oluşumunun piksel sayılarını belirlemek için sihirli değnek aracını kullanın; ardından bunu kontrollerle veya diğer değişkenlerle karşılaştırın. Burada, adipoz türevli stromal hücrelerin izolasyonundan, genişletilmelerine, farklılaşmalarına ve in vitro ve in vivo kullanımlarına kadar lipo aspiratın hasadı ve uygulamasının genel bir özeti verilmiştir. Alt sırada görülen, hidroksiapatit iskele aracılığıyla ASC uygulaması ile kritik boyutlu kafatası defektinin in vivo iyileşmesini gösteren bir mikro CT görüntüsü yer almaktadır.

Üst satırda görülen kontroller, iskelesiz ve defekt durumlarını içermektedir. Orta satır, hücre içermeyen iskelenin yerleştirildiği defek durumunu göstermektedir. Burada gösterilen LS, mikro BT'den elde edilen kemik iyileşmesinin nicelendirilmesidir ve A SC grubunda iyileşmenin anlamlı derecede arttığını göstermektedir.

Bu, andal aracılığıyla A SC grubunda artmış kemik oluşumunu gösteren histolojik bir görüntüdür. Mavi renkte ve pen AROM boyaması al için yapılmıştır. Mavi renkte, osteoid pen arom için koyu mavi boyanmıştır.

Burada gösterilen sarı renkli osteoid boyamaları, bir iskele üzerine ekilen ve iki hafta sonra sakrifiye edilen, GFP ile markalanmış insan ASC'leridir. Defekt bölgesindeki rejenerasyona katkıda bulunan insan hücrelerini göstermek için GFP markalı bir antikor ile boyama yapılmıştır. Burada, iki haftada defekt bölgesindeki insan hücrelerinin yaygınlığını gösteren insan nükleer antijen immünokimyası sunulmaktadır.

Uzmanlaşıldığında, adipoz doku işlemleri dört saat içinde tamamlanabilir ve cerrahi prosedür fare başına yaklaşık 10 dakika sürebilir. Parietal kemiğin yuvarlak, matkap ucunun ise düz olduğunu, bu nedenle dört milimetrelik defektin tüm çevresini delmek için dikkatli olunması gerektiğini unutmamak önemlidir. Beyindeki dura mater'e zarar vermemek için yavaş ilerlemeyi unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, progenitör hücrelerin adipöz dokudan nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu hücreleri bir iskeleye ekmeyi ve fareye yerleştirmeyi öğrenin.