Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, burada sunulan örnekteki gibi tek bir gen veya genetik diziden başlayarak, x-ışını kristalografisi ile bir hedef proteinin yapısal tayini için çoklu hedef yaklaşımını kullanmaktır. Hedef protein, viral replikasyonun temel bir bileşeni olan influenza A'dan PB2 polimeraz alt birimidir. Çoklu hedef yaklaşımı, öncelikle tek bir hedef diziye ve protein hakkında bilinen diğer bilgilere dayanarak bir dizi genetik konstrüktun paralel olarak tasarlanması ve klonlanmasıyla gerçekleştirilir.

İkinci adım, her bir konstrükt için ekspresyon seviyelerini test etmek ve hücre kültüründe büyük ölçekli protein ekspresyonu için en iyilerini seçmektir. Bir sonraki adım, hedef proteinleri ekspresyon materyalinden ayırmak için hücrelerin parçalanmasını ve her birinin çok yüksek saflıkta rafine edilmesini gerektirir. Ardından, X-ışını çalışmaları için uygun bir kristal form elde etmek amacıyla her bir proteinle bir dizi kristalizasyon denemesi düzenlenir.

Ardından, bir veya daha fazla kristal üzerinden yüksek çözünürlüklü x-ışını kırınımı verileri toplanır ve bu veriler, her bir hedef proteinin yapısını belirleyen bir elektron yoğunluğu haritasının çözülmesi ve optimize edilmesi için kullanılır. Bu sonuçlar, elektron yoğunluğu haritasına dayalı olarak hedef proteinin üç boyutlu bir yapısının oluşturulmasına olanak tanır. Çoklu hedef işleme, yol boyunca karşılaşılabilecek her potansiyel engel için uygulanabilir alternatifler sunarak yapı belirleme sürecindeki başarı olasılığını büyük ölçüde artırır.

Birden fazla hedefle paralel olarak çalışmak aynı zamanda oldukça verimlidir ve her adımda protein başına düşen zamanı ve maliyeti azaltır. İlaçla hedeflenebilir hedefler için yapı tayininin tamamlanma hızını artırma potansiyeli, yıllık daha fazla tedavi geliştirme fırsatına olanak sağlayacaktır. Bu yöntem yapısal biyolojide değerli bilgiler sunabilse de, bu yöntemler aracılığıyla elde edilen yüksek kaliteli proteinler, proteine dayalı her türlü araştırmayı destekleyebilir.

Sürecin her aşamasının kendine özgü bir bilimi vardır ve kendi uzmanlığını gerektirir; ancak insan kaynağına, enstrümantasyona ve teknik bilgiye yapılan yatırım, tüm parçalar bir araya getirildiğinde mükemmel sonuçlar verebilir. İnceleme için bir hedef gen ve gen ürünü seçildikten sonra, ilk adım çok sayıda genetik varyantın veya konstrüktün tasarlanmasını gerektirir. Bu konstrüktleri protein düzeyinde ve mühendislik ürünü sentetik gen dizileri üzerindeki ilgili kodlarla birlikte tasarlamak için gen kompozitör yazılımı kullanılır.

Hizalama görüntüleyici modülü ve konstrükt tasarım modülünü kullanarak protein sekans hizalamalarını karşılaştırın ve protein konstrükt tasarımı için insert PCR ve vektör PCR terminal primerlerini veya adaptörlerini tanımlayın. Ardından, her bir amino asit sekansını mühendislik ürünü bir nükleik asit sekans koduna geri çevirmek için gene composer'ın proteinden DNA'ya algoritmasını kullanın. Sekansı belirli bir hücre hattında ekspresyon için optimize etmek amacıyla uygun kodon kullanım tablosunu kullanın.

Bu durumda, e coli bakterileri kullanılacaktır. Hedef gen dizisi hazır olduğunda, geni sanal olarak klonlayın ve bakteriyel ekspresyon için uygun bir vektör plazmidine yerleştirin. Bu örnekte, modifiye edilmiş bir PET 28 vektörü kullanılmıştır.

Bu vektör, ekspresyon ve protein saflaştırması için gerekli olan belirli bileşenleri içerir. Hedef gen, proteinin N veya C terminusine bir histidin etiketi dizisi ve saflaştırma sırasında etiketin uzaklaştırılmasını sağlayacak bir kesim dizisi eklemek üzere modifiye edilmiştir. Vektör ayrıca, ekspresyon testi ve fermantasyon için bir antibiyotik direnç geni taşımaktadır.

Ardından, her bir hedef protein genetik dizisi, pipe klonlama polimeraz eksik primer uzatma klonlamasına hazırlık amacıyla standart gen sentezi yöntemleriyle oluşturulur; pipe klonlama, hedef genin hedeflenen vektörle tamamlayıcı primerler kullanılarak çoğaltıldığı PCR tabanlı bir klonlama stratejisidir. Bu yöntem, PCR ürünlerini değişken tek zincirli uçlarla bırakan geç evre PCR'ın tamamlanmamış doğasından yararlanır. Her bir reaksiyona beş µL ileri ve geri primer ekleyerek insert PCR veya IPCR'ı hazırlarım.

Bir plaka haritasına göre 96 kuyucuklu bir plakaya, her bir tam uzunluktaki sentetik genin iki µL'sini ilgili kuyucuğuna ekleyin. Her birine 25 µL PFU master mix ekledikten sonra, reaksiyonları aşağıdaki PCR koşullarını kullanarak 25 kez döngüye sokun. 95 °C'de 30 saniye boyunca denatüre edin.

45 saniye boyunca 50 °C'de denatüre edin ve üç dakika boyunca 68 °C'de uzatın. Fragman amplifikasyonu, IPCR ürünlerinin AGROS jel analizi ile doğrulanır. Başarılı IPCR ürünleri, belirgin bantlar ile temsil edilir.

İstenmeyen sonuçlar genellikle ayrı bir reaksiyonda sönük veya yayılmış bantlar şeklinde görülür. Ekspresyon plazmidi vektör PCR ile amplifiye edilir veya VPCR fragman amplifikasyonu, VPCR ürünlerinin AROS jel analizi ile doğrulanır. IPCR ve VPCR ürünleri amplifiye edildikten sonra, bir birleştirme plakasına eklenir ve birleştirme reaksiyonu için termosiklere yerleştirilir.

Başarıyla klonlanan yapılar daha sonra kimyasal olarak kompetan e coli hücrelerine transforme edilir ve ekspresyon testi ekimlerine başlamak üzere gliserol stoklarında saklanır. Klonlanmış yapıların her bir gliserol stokundan küçük bir miktar ayrı bir agar plakasına ekilir. Bakteriyel besiyeri ve vektörde kodlanmış olan Kanamycin antibiyotik markörü ile hazırlanan plaka, ertesi güne kadar 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir.

Taze olarak büyütülmüş agar plakadan tek bir koloni seçerek her örnek için bir ön kültür başlatın. Paralel işlemleme için bu koloniyi, kanamisin ve glukoz eklenmiş 1,2 milliliters TB besiyerini inoküle etmek için kullanın. Her ön kültür, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir blokta büyütülür.

Dakikada 220 devir çalkalamayla 37 °C'de gece boyunca büyütün. Gece boyu büyüme sonrası, inokülasyon için ön kültürden 40 µL kullanarak her örnek için küçük ölçekli indüksiyon kültürleri başlatın.

1,2 mililitre TB besiyeri. Mililitre başına 50 miligram kanamisin ve Novagen overnight express sistemi ile desteklenmiştir. Bir, indüksiyon kültürlerini 220 RPM'de çalkalayarak 20 °C'de 48 saat boyunca büyütün, hücreleri 4.000 G'de 15 dakika santrifüjle toplayın.

Süpernatantı dökün ve pelletleri, saflaştırma sonrası daha ileri işlemlerden önce en az bir saat boyunca -20 °C'de saklayın. Proteini, üretici protokolüne uygun olarak Caliper Lab CHIP 90 sistemi kullanılarak kapiler elektroforez ile kesim reaksiyonu varlığında ve yokluğunda analiz edin. İnfluenza A PB2 proteini durumunda, 34 konstrüktun 14'ü çözünür hedef protein sağlamış ve bir sonraki adım olan büyük ölçekli fermentasyona geçilmiştir.

Büyük ölçekli bir fermantasyona başlamak için, gliserol stokundan mililitrede 50 miligram Kanmycin içeren 100 mililitre bakteriyel hücre kültürü besiyerini inoküle edin ve 37 °C'de, 220 RPM'de çalkalayarak gece boyunca büyütün. Ertesi gün, inokülasyon için 10 mililitre kullanarak ön kültürü genişletin.

İki litrelik bölmeli bir erlene, oto-indüksiyon medyası ve mililitre başına 50 miligram kanamisin içeren bir litre besiyeri ekleyin. Genişletilmiş kültürleri 37 °C'de yaklaşık her 30 dakikada bir çalkalayın. Kültürün optik yoğunluğunu, 600 nm dalga boyunda UV absorbansını ölçerek kontrol edin.

0,6 optik yoğunluğa ulaşıldığında, istenen büyüme süresinden sonra çalkalamalı inkübatörün sıcaklığını 20 °C'ye düşürün. Ekspresyon testi için her bir konstrüktten temsilci 10 mL'lik bir alikot alın. Hücreleri 5.000 ×g'de 15 dakika santrifüj ederek hasat edin.

Süpernatanla dökün ve hücre peletini -80 °C'de dondurun. Bu prosedüre başlamak için, hücre pastasını çözün ve bir ila beş ana hacim oranında lizis tamponunda yeniden süspanse edin. 4 °C'de 30 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.

Beher kenarına yapışmış topakları ayırmak için temiz bir spatula kullanın. Hücreleri buz üzerinde, bir sonikatör yardımıyla mekanik olarak lyse edin. Ham lizatı, 4 °C'de 30 dakika boyunca 18,000 GForce biriminde santrifüj ederek berraklaştırın.

Süpernatantı toplayın ve büyük ölçekli saflaştırmaya geçmeden önce analiz için küçük bir alikot saklayın. Her bir kültürün büyük ölçekli protein ekspresyonunu SDS-PAGE jel analizi ile doğrulayın. Bu temsili SDS-PAGE sonucu, güçlü protein ekspresyonu, yaklaşık %50 çözünürlük ve yaklaşık %50 kesilme göstermektedir.

Bu vakada, orijinal yapıya dahil edilen bir protein çözünürlük etiketi ile birlikte histidin etiketi kaldırılmıştır. Hedef proteini, kendine özgü histidin etiketi aracılığıyla, yerli bakteriyel proteinler dahil tüm diğer hücresel materyallerden ayırmak için nikel reçine kullanılır. Bir nikel kolon, saklama tamponunu uzaklaştırmak için dört kolon hacmi DEsu ile yıkandıktan sonra, bir kolon hacmi tampon B ve beş kolon hacmi tampon ile yıkanarak hazırlanır.

A'dan E'ye dengeleme paralelleştirmesi, aynı anda birden fazla kolonu çalıştırabilen protein yapıcı ile gerçekleştirilir. Solubilize edilmiş protein ve histidin etiketi içeren her bir berraklaştırılmış lizatı, dakikada iki mililitre hızla ayrı bir kolona yükleyin; ardından tampon A ile birkaç kolon hacmi kadar yıkama yapın, akış tamponunu toplayın ve analiz için saklayın. Bağlanmış proteini; tampon A ve B ile %95'e %5, %60'a %40 ve son olarak %100 tampon B şeklinde bir dizi basamaklı gradyanla elüe edin. Tampon B'deki bileşenler, nikel reçine için histidin ile yarışır ve böylece proteini belirli bir oranda kolondan uzaklaştırır.

Her bir elüsyon fraksiyonunu ayrı ayrı toplayın. Nikel kolonda gerçekleştirilen bir çalışmadan elde edilen temsili bir kromatogram sonucu burada gösterilmiştir. Nikel kolonundan elüe olan fraksiyonları, ham lizatı, berraklaştırılmış lizatı ve nikel kolon akışını (flow through) SDS-PAGE ile analiz edin ve kolon saflaştırması sırasında toplanan 280 nanometredeki UV absorbansı ile karşılaştırın.

Bu adım, saflaştırmanın başarılı olup olmadığını belirler. Daha ileri işlemler için hedef proteini içeren fraksiyonları seçin ve birleştirin. 280 nanometredeki UV absorbansını ölçerek ve birleştirilen fraksiyonların toplam hacmini hesaba katarak, proteinin teorik sönüm katsayısı ile bu aşamadaki toplam protein miktarını hesaplayın.

Analiz için küçük bir örnek saklayın. Hedef protein için kullanılan gen, ULP1 tarafından bir kesim bölgesi olarak tanınan spesifik bir sekansla kodlanmıştır; bu nedenle ULP1 eklenmesi, histidin etiketi ile ilgili protein arasında kesilme ile sonuçlanır. Bu prosedüre başlamak için, havuzlanmış fraksiyonlarda bulunan her beş miligram protein için bir mikrolitre ubiquitin benzeri proteaz, bir ekleyin.

Bu aşamada, kesilmiş protein, diyaliz tüpü kullanılarak daha ileri işlemler için tampon B'den tampon A'ya aktarılır; protein, dört santigrat derecede, karıştırılarak iki litre tampon A karşısında dört saat boyuncale diyalize edilir. Diyaliz sonrası PB two için 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme sınırı kullanın. Hedef proteinin ULP one varlığında ve yokluğunda başka bir SDS page jeli çalıştırın.

Bu işlem, ULP one kesiminin başarılı olup olmadığını belirleyecek ve daha ileri işlemler için kullanılacak en iyi fraksiyonların seçilmesine olanak sağlayacaktır. Burada, polimeraz pb'nin üç farklı konstrüktü için temsilci SDS page sonuçları gösterilmiştir. Birinci şeritte iki alt birim moleküler ağırlık belirteçleri yer almaktadır.

İki, altı ve 10. şeritler, nikel bir kolonlarından toplanan proteinlerdir. Üç, yedi ve 11. şeritler, nikel ikiden gelen tampon A içerisindeki kesilmiş proteinin akış yolu örneklerini; dört, sekiz ve 12. şeritler ise nikel ikiden gelen tampon B içerisindeki histidin etiketinin uzaklaştırılmasını göstermektedir.

Histamin uzaklaştırıldıktan sonra, nikel iki aşamasından elde edilen birleştirilmiş fraksiyonlar konsantre edilir. SEC işlemine başlamak için, hedef molekül ağırlığına göre uygun reçine yeniden seçilmelidir. Bu durumda, Superdex 200 Increase 10/300 GL kolonu kullanılır ve 5 mL'lik bir şırınga yardımıyla 0,5 mL/dakika akış hızında 200 mL SEC tamponu ile dengelenir; numune 10 mL'lik numune döngüsüne yüklenir ve SEC kolon çalıştırılmasına başlanır. Küçük hacimli fraksiyonlar toplanırken 280 nanometrede UV absorbans kromatogramı izlenir.

Tüm ilgili SEC fraksiyonlarını SDS-PAGE ile analiz edin. Protein kristalizasyon denemeleri için standart yaklaşım, buhar difüzyonunu içeren oturan damla yöntemi ile yürütülür. Her bir hedef protein için başlangıçta iki veya daha fazla seyrek matris taraması kurmak yaygın bir uygulamadır.

Bu işleme başlamak için, 96 kuyucuklu kompakt junior kristalizasyon plakasının her bir rezervuarını, seçilen kristalizasyon taramasındaki her bir koşuldan 80 µL ile önceden doldurun; SEC tamponu içindeki proteinden 0,4 µL'yi 96 kuyucuğun her birine dağıtın. Ardından, her bir kuyucuktaki damlanın tamamen karıştığından emin olarak 0,4 µL kristalizasyon tarama solüsyonu ekleyin. Tüm plakayı, her kuyucuğun tamamen mühürlendiğinden emin olacak şekilde kristal netliğinde sızdırmaz bant ile kapatın ve plakayı 16 °C'de, çevresel titreşimlerin olmadığı sarsıntısız bir yerde saklayın.

Önümüzdeki birkaç hafta boyunca protein kristallenmesini bir diseksiyon mikroskobu altında periyodik olarak kontrol edin. Protein kristalleri oluşmazsa, hasat işleminden önce başarı olasılığını artırmak için farklı koşullarda yeni plakalar hazırlayın ve final damlasındaki protein konsantrasyonunu değiştirin. Hasat işlemine başlamak için sıvı azotla dolu bir kapta ALS tipi bir puck'ı soğutun ve bir kapakla örtün.

Hedef protein kristalinin bulunduğu kuyuyu örten şeffaf bandı yakınındaki boş bir kuyuya kadar kesin. Karşılık gelen kristalizasyon koşulundan 1,6 µL ekleyin ve bunu 0,4 µL etilen glikol ile birleştirin. Kristalizasyon koşulunda %20 etilen glikol içeren çözelti, protein kristalini korur.

Kriyodondurma sırasında, kristali mikroskop altında analiz edin ve kristalin maksimum genişliğine uygun iç çapta bir kriyodöngü seçerek hasat işlemini gerçekleştirin. Kriyodöngüyü manyetik bir kristal çubuğuna takın ve kristali doğrudan kuyucuk çözeltisinden alın. Hasat edilen kristalin bulunduğu kriyodöngüyü derhal bir kriyoprotektana batırın ve ardından LS tipi bir puck içerisine daldırın.

Hızlı dondurma işlemi için, istenen sayıda kristali tekrarlayarak dondurun. Toplama işlemi tamamlandığında, bükülmüş dillerle birlikte hızlı dondurulmuş kristallerin bulunduğu puck üzerine manyetik kapağı yerleştirmek için bir puck çubuğu kullanın. Bir sonraki adım için puck'ı ters çevirin.

Bir puck pusher'ı puck üzerine vidalayın, ardından puck'ı KU actor doer'a aktarın ve kapağı çıkarmak için bunu kullanın. Puck içindeki kristaller, J Director görüntüleme yazılımı kullanılarak yapılacak x-ışını kırınımı çalışmalarına hazır olana kadar sıvı azot banyosunda donmuş halde tutulur. Kristal tarama için şu parametreleri ayarlayın: huzme yarığı 0.5 derece, dedektör mesafesi 50 milimetre, görüntü adımı 70 derece ve pozlama süresi 30 saniye.

Bir kristal taranırken görüntüleme yazılımından alınan örnek bir ekran görüntüsü burada verilmiştir; orta panel, temsili bir kristalden gözlemlenen x-ışını kırınımını göstermektedir; üç boyutlu yapı belirleme için gerekli olan eksiksiz bir veri seti için yüksek çözünürlükte yeterli görüntü toplanmıştır. Bu videoda gösterilen klonlama ve protein saflaştırma stratejileri sonucunda 14 saflaştırılmış PB two örneği elde edilmiş ve bunlardan dokuzu kırınım çalışmaları için uygun kristaller vermiştir. Kurum içi x-ışını kırınımı veri seti, ossec variax hf, HF optikleri ve bir Saturn 944 plus CCD detektör ile donatılmış bir rigaku super bright FRE plus döner anot x-ışını jeneratörü kullanılarak, QK alfa radyasyonu ile dokuz konstrükttan beşi üzerinde toplanmıştır.

Polimeraz PB iki alt biriminin bir X-ışını kırınım görüntüsü burada gösterilmiştir. Her bir veri seti işlenmiş ve PB iki alt biriminin toplam dört yapısı belirlenmiştir. Her bir yapı hakem değerlendirmesinden geçirilmiş ve halka açık erişim için protein veri bankasına yüklenmiştir.

Bu şekil, kristalografik asimetrik birimdeki moleküllerin şerit diyagramlarını göstermektedir. Dört PB2 yapısının ikincil yapıları, ilgili PDB kodlarıyla birlikte gökkuşağı deseninde renklendirilmiştir. Bu tabloda, bu video makalesinde açıklanan yöntemlerle influenza PB2 hedefleri için yapılan sonuç analizi yer almaktadır.

Genden yapı belirlemeye yönelik çok hedefli paralel işleme hattı; klonlama, çözünürlük, saflaştırma, kristalizasyon ve yapı belirleme olmak üzere beş adımda örneklendirilmiştir. Yapısal biyoloji hattımızın çıktısı, yalnızca yapı tabanlı araştırmalar için temel oluşturmakla kalmaz, aynı zamanda protein fonksiyonunu onaylamak için fonksiyonel analizler veya ilaç geliştirme için yeni başlangıç noktaları belirlemek amacıyla MAR veya SPR ile yeni bileşiklerin biyofiziksel taraması gibi ek çalışmalara da veri sağlar. Bu teknik ve beraberinde geliştirilen araçlar, insan sağlığı ve hastalıkları üzerinde büyük etkisi olan yapı tabanlı ilaç tasarımı da dahil olmak üzere, yapısal biyologların keşif tabanlı birçok araştırmayı gerçekleştirmesinin yolunu açmaya yardımcı olmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, çok hedefli paralel işlemenin yapı tayininin başarısını nasıl büyük ölçüde artırabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Yapısal biyoloji laboratuvarında çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve laboratuvar faaliyetlerinde bulunurken KKD kullanımı gibi uygun önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.