İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dilate kardiyomiyopati veya otoimmün temelli diğer kalp hastalıkları olan hastaların plazmasındaki kardiyotropik antikorları tespit etmektir. Bu, ikinci bir adım olarak immünoglobulin G'yi saflaştırmak amacıyla, hasta plazmasının anti IgG spheros kolonlarında başlangıçta mini immün absorpsiyon işlemine tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. Bu biyolojik analiz için hücresel temel sağlamak amacıyla yetişkin Wistar sıçanlarından ventriküler kardiyomiyositler izole edilir.

Ardından, kasılmalar sırasında hücre içi kalsiyum geçişlerinin gözlemlenebilmesi için kardiyomiyositlerin oda lamlarına tutunmasına izin verilir ve URA 2:00 AM ile boyanır; daha sonra, hastanın IgG'sinin kardiyomiyosit kontraktilitesi üzerindeki etkisini gözlemlemek için testi yapılır. Sonuçlar, izole edilmiş kardiyomiyositlerdeki kontraktilite ve kalsiyum geçişindeki değişikliklere dayanarak, hastanın IgG'sinin tropik antikorlar içerip içermediğini gösterir. Bu tekniğin, antikorların tespiti için kullanılan standart immünolojik testler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, spesifik bir antijenden bağımsız olması ve stimüle eden ile bloklayan antikorlar arasında ayrım yapmaya olanak sağlamasıdır.

Prosedürün gösterimi Google tarafından gerçekleştirilecek ve laboratuvarımızdan teknik destek sağlanacaktır. Bu prosedüre başlamak için, boş bir econopak kolonuna her 2 mL hasta EDTA plazması başına 3 mL anti IgG spheros doldurarak mini immünoadsorpsiyon kolonlarını hazırlayın. Ardından, anti IgG spheros'ların üzerine bir filtre yerleştirin.

Kolonun alt ucunu kesin ve yaklaşık saniyede bir damla akış hızına ulaşmak için filtreye bastırın. Ardından kolonu, bir plazma hacmi %0,9 Sodyum klorür ile üç kez yıkayın; plazma anti IgG Spheros'lara tamamen nüfuz ettiğinde kolondaki plazmayı pipetle çekin ve aynı hacimde %0,9 sodyum klorür ile yıkayın. Sonra, kolona pH 2.8'de 0,2 molar glisin hidroklorürden bir plazma hacmi ekleyin ve fazlara nüfuz etmesini bekleyin.

Ardından kolona bir hacim daha glisin hidroklorür ekleyin. Akışı 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve kolonu rejener etmek için pH 8.0'de 0.5 molar tris hidroklorür ile pH'ı 7.3'e ayarlayın. İki hacim %0.9 sodyum klorür ile yapılan son yıkamanın ardından kolonu üç plazma hacmi glisin hidroklorür ile yıkayın.

Kolon, kardiyomiyositler üzerinde kullanılmak üzere bir sonraki plazma örneği için yeniden kullanılabilir. Toplanan IgG fraksiyonu, önce 100 kilodalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir selüloz ester diyaliz membran tüpüne doldürülerek deneysel tampon ile diyalize edilmelidir. Ardından tüp bir litre EB içerisine yerleştirilmeli ve dört derece Celsius'ta manyetik karıştırıcı ile yavaşça karıştırılmalıdır. Sekiz saat sonra, diyaliz tüpü üç litre taze EB içerisine aktarılmalı ve diyaliz işlemini takiben dört derece Celsius'ta 20 saat daha diyaliz edilmelidir.

Numuneyi bir benmari banyosunda 57 °C'de 30 dakika boyunca kaynatın. Kompleman faktörlerini inaktive etmek için toplam IgG konsantrasyonunu belirleyin ve her biri 330 µg IgG içeren alikotlar hazırlayın. Bu prosedürde, beraberindeki makaleye uygun olarak kalsiyum içermeyen izolasyon tamponu hazırlayın.

Ardından, bir termostatik lanor perfüzyon sisteminin üst rezervuarına 80 mililitre IB doldurun, tamponu 37 °C'de tutun ve 30 dakika boyunca %95 oksijen, %5 karbondioksit ile havalandırın. Yaklaşık 7.000 ila 10.000 ünite tip iki kollajenazı ve 174 miligram yağ asidi içermeyen BSA'yı, 112,5 µM kalsiyum klorür içeren 20 mililitre IB içerisinde çözün ve gerekirse üst rezervuardaki izolasyon tamponunun pH değerini ayarlayın.

Ardından, tiopental çözeltisine 2.500 IU heparin ekleyerek, kg başına 375 µg tiopental kullanarak 175 ila 200 gram ağırlığındaki bir wistar sıçanı anestezi edin. Torakotomi sonrası kalbi, aort arkı sağlam kalacak şekilde dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk, %0 sodyum klorür içeren buz gibi soğuk sodyum klorür çözeltisine aktarın. Kanı ve kalbi çevreleyen dokuları temizleyin.

Ardından numuneyi taze %0.9 sodyum klorüre aktarın ve aortu açığa çıkarın. Saniyede iki ila üç damla hız elde etmek için langor sisteminin akış azaltıcısını açın. Daha sonra kalbi kanüle bağlayın.

Kalan kanı temizlemek için saniyede bir damla akış hızıyla üç dakikaya kadar perfüzyon uygulayın. Ardından, IB'yi LOR sisteminde sirküle edin. Şimdi üst rezervuardan 20 mililitre tampon çözelti çıkarın.

Rezervuarı kollagenaz çözeltisiyle doldurun ve 80 mililitreye ulaşmak için gerekli miktarda tampon çözelti ekleyin. Ardından, sindirim çözeltisini 27 dakika daha sirküle edin. Sonrasında, kalbi kanülden ayırın.

Atriyumları ve aortu çıkarın, ardından ventrikülleri küçük parçalara bölün. Sindirim tamponunun alt rezervuara akmasına izin verin. Doğranmış ventrikülleri %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile sürekli havalandırma altında 10 ila 15 dakika daha sindirmek için hacmi maksimum 40 mililitreye düşürün.

Ardından, hücre süspansiyonunu 200 mikron gözenek boyutundaki bir gazlı bezden süzerek 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Son olarak, hücre süspansiyonunu 40 3G'de iki dakika boyunca santrifüj ederek hücrelerin kalsiyum içeriğini geri kazandırın. Oda sıcaklığında, hücreleri 10 mililitre içerisinde yeniden süspanse edin.

200 µM kalsiyum klorür içeren IB tekrar santrifüj edilir ve hücreler 10 mL içerisinde yeniden süspanse edilir. 500 µM kalsiyum klorür içeren IB kullanılır. Son bir santrifüj işleminden sonra, kardiyomiyositler steril filtrelenmiş EB içerisinde mililitrede 50.000 hücre yoğunluğuna ulaşacak şekilde yeniden süspanse edilir.

Dört kuyucuklu bir oda içindeki lamel camlarını her kuyucuk için 10 micrograms laminin ile kaplayın ve tamamen kurumasını bekleyin. Ardından, her kuyucuğa bir mililitre kardiyomiyosit süspansiyonu doldurun. Ucu kesilmiş bir mikro pipet kullanarak hücrelerin oda sıcaklığında bir saat boyunca yapışmasını sağlayın; bir miligram per mililitre fira 2:00 AM stok çözeltisinin 10 microliters miktarını beş mililitre eb içinde seyreltin ve boyama çözeltisini karanlıkta tutun.

Ardından, lamel üzerindeki tampon çözeltiyi ve yapışmamış hücreleri uzaklaştırın ve 0.5 milliliters boyama çözeltisi ekleyin. Hücreleri her bir kuyucukta orta derecede çalkalama altında 10 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, boyama çözeltisini uzaklaştırın ve hücreleri bir milliliter eb ile bir kez yıkayın.

Ardından, bu prosedürdeki her bir kuyucuğa 0,5 milliliters EB ekleyin, lamel camı miyosit kalsiyum ve kontraktilite kayıt sistemine bağlı bir ters floresan mikroskobunun altına yerleştirin. İlk kuyucuğa giriş ve çıkış tüplerine sahip özel yapım bir elektrot yerleştirin ve kardiyomiyositleri dakikada bir milliliter eb ile süperfüze edin.

Elektrik stimülasyonuna 20 volt, bir hertz ve darbe başına beş milisaniye süre ile başlayın ve hücrelerin stimülasyona adapte olması için yaklaşık iki dakika bekleyin. Belirgin çizgilenmeye ve sabit kontraksiyona sahip, sağlam, çubuk şeklinde bir kardiyomiyosit seçin ve bunu görüş alanının merkezine konumlandırın. Ardından kamera kanalını açın; hücre çerçeveleme adaptörünü döndürerek ve mikroskop tablasını hareket ettirerek hücreyi video alanı içerisinde yatay olarak yönlendirin.

Video alanındaki tespit kontrol elemanlarının sınırlarını ayarlayın. Başlangıç hücre kısalmasını ve kalsiyum geçişini elde etmek için floresan kanalını açın ve 10 ila 15 kontraksiyon kaydedin. Ardından, floresan boyanın ağarmasını önlemek için mikroskop ışık kanalını kapatın.

Üç yollu bir vana ile akışı EB'den örnek bypass hattına yönlendirin ve kardiyomiyositleri bir mililitre hasta IgG ile süperfüze edin. Hava kuyuya ulaşmadan hemen önce pompayı durdurun, ışık kanalını açın ve akut hücre yanıtını elde etmek için 10 ila 15 kasılma daha kaydedin. Ardından kaydı durdurun ve ışık kanalını tekrar kapatın; kayıtları iki ve beş dakika sonra tekrarlayın ve işlem tamamlandığında elektrodu kuyudan çıkarın. Son aşamada, sırasıyla kenar uzunluğu/uzunluk (edge length/length) ve URA iki sayısal çıkarılmış/oran (URA two numeric subtracted/ratio) pencerelerini kullanarak ion wizard yazılımı ile hücre kısalmasını ve kalsiyum geçişini analiz edin.

Ardından, akut, iki dakikalık ve beş dakikalık yanıtlar için başlangıç hücre kısalması ve kalsiyum transiyent pik yüksekliğine göre yüzde değişimleri hesaplayın. İşte kontrol ölçümüne dair temsili bir örnek. Hücre kısalması ve kalsiyum transiyenti, IgG süperfüzyonundan önce ve IgG süperfüzyonundan hemen sonraki ikinci ve beşinci dakikalarda çevrim içi olarak izlenmiştir.

İşte kardiyodepresif antikorlar içeren bir IgG örneğinin ölçümüne bir örnek. Hücre kısalması ve kalsiyum transiyenti, IgG süperfüzyonundan önce çevrimiçi olarak ve IgG süperfüzyonundan hemen sonra iki ve beş dakika içinde ölçülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, izole yetişkin fare kardiyomiyositlerinin hücre kısalması ve kalsiyum transiyenti üzerindeki izole IgG etkisini ölçerek, hasta plazmasındaki kardiyotoksik antikorların nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.