Kemik Metastaz Modelleri

Bu prosedürün genel amacı, kemikte tümör hücresi büyümesini ve ardından kemik yıkımını tetikleyecek şekilde tümör hücreleri enjekte etmektir. Bu işlem, öncelikle tümör hücrelerinin soğuk PBS içinde resüspanse edilmesi ve buz üzerine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, uygun sayıda hücre, anestezi altındaki bir farenin sol kardiyak ventrikülüne veya tibiasına enjekte edilir.

Ardından kemik tümör büyümesi ve kemik parametreleri, çoklu görüntüleme teknikleri aracılığıyla boylamsal olarak izlenir. Son olarak, tümör ve kemik parametrelerinin uç nokta kantifikasyonu gerçekleştirilir. Nihayetinde, in vivo ve ex vivo floresan veya lüminesans 2D radyografi 3D'nin bir kombinasyonu kullanılır.

Tümör büyümesini ve kemik mikroçevresindeki değişiklikleri hücresel ve büyüme yapısal düzeylerinde göstermek için mikro CT ve histoloji kullanılır. Bu yöntemler, meme ve prostat kanserinin metastatik kolonizasyonuna kemikte hangi faktörlerin izin verdiği gibi, kanser metastazı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre hazırlığını, laboratuvarımdaki araştırma görevlisi Alisa Merkel gösterecektir, hücreleri bir haftadan daha kısa süreyle muhafaza edin.

GFP etiketli M-D-A-M-B 2 3 1 klonunu içeren hücreleri, %10 FBS ve 0,1 mg/mL penisilinle streptomisin içeren DMEM içerisinde, 37 °C sıcaklıkta ve %5 ila %8 CO₂ ortamında kültüre edin. Hücreler %80 ila %90 konfluense ulaştığında pasajlayın ve 1:10 dilüsyonla yeniden ekim yapın. Hücreleri inokülasyona hazırlamak için, %80 ila %90 konfluense ulaştıklarında 10 mL 0,15% tripsin EDTA kullanarak tripsinizasyon yapın.

%10 FBS içeren buz gibi soğuk DMEM ile hücreleri derhal 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti 50 mililitrelik konik bir tüp içerisinde 25 mililitre buz gibi soğuk, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yeniden süspande edin ve hücreleri sayın; hücreleri tekrar peletleyin ve intramiyokardiyal inokülasyon için mililitre başına 10⁶ hücre, intratibiyal enjeksiyon için ise mililitre başına 250.000 hücre konsantrasyonunda buz gibi soğuk PBS içerisinde yeniden süspande edin.

Bu deneyler için, enjeksiyondan beş ila 10 gün önce Tela 29 20 x diyetiyle beslenmiş, dört ila altı haftalık dişi immün yetmezliği olan fareler kullanılır. Fareyi %2,5 isof fluorine içeren bir hazne içerisinde anesteziye aldıktan sonra, fareyi havalandırmalı bir davlumbaz altında burun konisine taşıyın ve sırtüstü konumlandırın. Göğüs bölgesini temizlemek için önce %10 povidon iyot çözeltisi, ardından %70 Ethanol kullanın.

Enjeksiyon için farenin göğüs bölgesini, sternal çentik ile ksifoid çıkıntının üst kısmı arasındaki orta noktaya ve sternumun hafifçe soluna işaretleyin. Ardından, 300 mikrolitrelik 28 gauge yarım inçlik bir insülin şırıngası kullanın. Piston ile menisküs arasında boşluk oluşturmak için küçük bir hava kabarcığı çekin ve bir elinizle farenin derisini gergin tutarken 100 mikrolitre hücre çekin.

İğneyi dik tutun ve yerleştirin; sol kalp ventrikülüne başarılı bir giriş, şırıngada belirgin, parlak kırmızı bir kan nabzı ile sonuçlanmalıdır. Bu derinlikte, kalbi delmemek veya göğüs boşluğuna hücre sızdırmamak için iğneyi önemli ölçüde hareket ettirmeden şırınga pistonunu dikkatlice bastırın. Hücrelerin göğüs boşluğuna damlamasını azaltmak için, az miktarda negatif basınç oluşturmak amacıyla pistonu hafifçe yukarı çekin.

Ardından, iğneyi çıkarırken eğilmediğinden emin olarak doğrudan göğüsten çekin; iğnenin eğilmesi kalp zarının yırtılmasına ve kanamaya neden olabilir. Kanamayı azaltmak için enjeksiyon bölgesine yaklaşık bir dakika boyunca hafifçe basınç uygulayın. Burun konisini çıkarırken, fare tamamen bilinci yerine gelene kadar onu bir ısıtma pedine taşıyın.

İntratibial prosedürden hemen önce, fareye bup printex enjekte edin. Fareyi anestezi altına alıp burun konisine yerleştirdikten sonra, her iki bacağı önce %10'luk povidon iyot ile, ardından dört parmak ve başparmak şeklinde ethanol ile temizleyin.

Lateral malleolü, medial malleolü ve tibianın alt yarısını nazikçe kavrayın. Ardından, diz görünür ve erişilebilir olacak şekilde bacağı bükün. Altında bulunan patella ligamanının görünürlüğünü artırmak için %70 ethanol ile cildi ıslatın; ayak bileği sıkıca tutulurken bu ligaman belirgin, kalın beyaz bir çizgi olarak görünmelidir.

28 gauge yarım inçlik bir iğneyi, patella ligamentinin ortasından geçerek patellanın altına ve tibianın üst kısmındaki anterior interkondiler alana yerleştirin. İğneyi büyüme plağından dikkatlice geçirmek için hafif bir delme hareketiyle birlikte sabit ve güçlü bir basınç uygulayın. Tibial büyüme plağına girildiğinde, iğne belirgin şekilde daha az dirençle karşılaşacaktır.

İğnenin tibia içerisinde ve büyüme plağının ötesinde olduğundan emin olmak için iğneyi nazikçe yanlara doğru hareket ettirin. İğne, tibianın içerisinde doğru konumdaysa hareket alanı sınırlı olacaktır. 10 µL hücre solüsyonu enjekte etmek için pistonu yavaşça aşağı bastırın.

Bu noktada çok az direnç hissedilmeli veya hiç hissedilmemelidir. Ardından iğneyi yavaşça geri çekin. Fareyi anesteziden çıkarın ve iyileşene kadar bir ısıtma pedinin üzerinde tutun.

Fareleri haftada iki ila üç kez gözlemleyin. Anestezize edilmiş fareler üzerinde lusiferaz, GFP floresansı ve röntgen gibi çeşitli görüntüleme teknikleri uygulanır. Floresans, tümör bölgelerini belirtir.

Lezyonların yerini belirlemek için estron taraması kullanılır. Lezyonlar, floresan görüntülerle korelasyon gösterir. Görüntüleme teknikleri hakkında daha fazla ayrıntı, bu protokolün yazılı bölümünde bulunabilir.

Enjeksiyondan 21 ila 35 gün sonra. Fareleri IACUC onaylı bir yöntemle sakrifiye edin ve kemikleri %4'lük Formalin içinde saklayın; izole edilen kemikler üzerinde mikro CT ve hematoksilin ile DSN boyamasıyla histo-morfolojik ex vivo analizler gerçekleştirin. Detaylar, tümör hücrelerinin intrakardiyak veya intratibiyal inokülasyonunu takip eden yazılı protokolde bulunabilir.

Fareler, radyografi ve floresans veya lüminesans ile haftalık olarak izlenir. Lezyonlar normalde ikinci ve üçüncü haftalar arasında röntgen ile belirgin hale gelir. Burada gösterildiği gibi modele bağlı olarak, floresans ve lüminesans ile ikinci hafta kadar erken görünseler de, lezyonlar kemikte koyu delikler şeklinde görünür ve zamanla daha belirgin hale gelebilirler. Lezyonlar, radyografların ve floresansın metamorph analizi kullanılarak nicelleştirilmiştir.

Maestro görüntüleme kazanım ve analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi. Bu şekilde, kemik kaybı mikro CT analizi ile nicelendirilmiştir. Mikro CT ölçümlerinden elde edilen kemik yapısal ve mineral verileri; sağlıklı kemiğin ve kemik yıkım bölgelerinin boş alanlar olarak gösterildiği tümör taşıyan kemiğin 3B görüntüleri olarak sunulmuştur.

Ardından, tümör yükünü ve kemik hacminin doku hacmine oranını belirlemek için örnekler üzerinde histo morfoloji geometrisi uygulandı. Bu prosedürleri gerçekleştirirken sabırlı olmak, her bir fareyi dikkatle yerleştirmek ve fareleri yakından izlemek önemlidir. Eğer ölmeye başlarlarsa, bunun muhtemelen hücre kümelenmesinden kaynaklandığını varsaymalı ve derhal yeni hücreler hazırlamalısınız.

Yapabileceğiniz en kötü şey, prosedürleri aceleye getirmek veya hüsrana uğramaktır. Unutmayın, daha fazla pratik ve zamanla, gelişimden sonra daha iyi ve daha hızlı hale geleceksiniz. Bu teknikler, kanser araştırmacılarının kemik metastazını in vivo olarak incelemelerinin önünü açmıştır.