Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Bu prosedürün genel amacı, NK T hücrelerinin genişletilmesi için CD 1D tabanlı yapay antijen sunan hücreler veya aAPCs üretmektir. Bu işlem, öncelikle manyetik boncukları fonksiyonelleştirmek için proteinlerin eklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, periferik kandaki başlangıç NK T hücresi popülasyonu zenginleştirilir.

Ardından, zenginleştirilmiş T hücreleri A A PC ile birlikte kültüre edilir. Son adımda, A A PC hücre popülasyonunun fenotipi ve fonksiyonu değerlendirilir. Nihayetinde, genişletilen T-hücre alt kümelerinin saflığı akış sitometrik analizi ile belirlenebilir. APC'lerin dendritik hücreleri kullanan mevcut yöntemlere göre temel avantajı, dendritik hücrelerde donör değişkenliğinin yüksek olabilmesidir.

aAPC'ler, NK T hücrelerinin genişletilmesi için tekrarlanabilir, hazır ve standartlaştırılmış bir yöntem sunar. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, Johns Hopkins'te Dr. Schneck ve ekibiyle çalıştığım sırada edindim. Kendileri, klasik CD8 T-hücresi alt kümelerinin genişletilmesi için yapay antijen sunan komplekslerin kullanımı alanında öncülük etmişlerdir.

Prosedürü, doktora sonrası araştırmacı Dr. James East ve laboratuvarımdan bir araştırmacı ortağı olan Dr. Wendy'nin oğlu uygulamalı olarak gösterecektir. Bir mililitre dyna bead M four 50 epoksi boncuğunu beş mililitrelik şeffaf borosilikat cam vidalı şişeye aktararak başlayın. Ardından boncukları, ayrı bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü içerisinde üç mililitre steril bore eight tamponu ile durulayın.

100 µg insan CD 1D IG dimerini ve istenen ko-stimülatör moleküllerin 20 µg'ını, bir mL kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'ye ekleyin. Ardından, boncuk içeren cam şişeyi bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve borat tamponunu aspire edin. Daha sonra protein karışımını cam şişeye ekleyin ve kapağı kapatın.

Flakonu ters çevirerek çözeltiyi hemen karıştırın, ardından kapağı parafilm ile kapatın ve gece boyunca dört derece Celsius'ta bir rotatör üzerinde bekletin. Cam flakonu tekrar mıknatıs üzerine yerleştirin ve protein karışımını boncuklara değdirmemeye dikkat ederek dikkatlice uzaklaştırın. Üç mililitre boncuk yıkama tamponu ekleyip dört derece Celsius'ta rotatör üzerinde beş dakika inkübe ederek boncukları üç kez yıkayın.

Proteinlerin boncuklara stabil bir şekilde yüklendiğini doğrulamak için, boncukların bir kısmını antikorlarla boyayın ve akış sitometrisi analizi ile analiz edin. Şimdi, 5 × 10⁷ adet boncuğu 1,5 mL'lik küçük bir cam şişeye aktarın ve boncukları 1 mL steril PBS ile yıkayın. Ardından kullanımdan 48 ila 72 saat önce.

Boncuklar antijenle yüklenirken, yıkanmış boncukları bir mililitre steril PBS içindeki antijen ile yükleyin. Heparinli donör kanını önce oda sıcaklığında eşit hacimde PBS ile seyrelterek PBMC'leri toplayın. Ardından, 50 mililitrelik konik tüplere 15 mililitre oda sıcaklığında PHI ekleyin ve seyreltilmiş kan karışımının 25 mililitresini yavaşça PHI'nin üzerine katman olarak ekleyin.

Ardından, örnekleri fren kapatılmış şekilde oda sıcaklığında 700 ×g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Lenfosit ara yüzeyini bir pastör pipeti kullanarak dikkatlice yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. Sonrasında, lenfositleri 50 mL PBS ile yıkayın, süpernatanı uzaklaştırın ve aynı donöre ait tüpleri tek bir tüpte birleştirin.

PBMC'leri tekrar 20 milliliters PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri sayın ve ardından max buffer içerisinde beş times 10 to the seventh cells per milliliter konsantrasyonda yeniden süspande edin. T-hücresi fraksiyonunu izole etmek için, EP human T-cell enrichment kitinden 100 microliters PAN T-cell enrichment solution'ı, iki milliliters PBMC ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, çözeltiyi 100 microliters manyetik boncuklarla oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe edin.

Çözücünün nihai hacmini 2,5 mililitreye tamamlayın ve ardından tüpü mıknatısa yerleştirin. Beş dakika sonra, CD3 pozitif fraksiyonu hızlıca 15 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın. Şimdi hücreleri beş mililitre soğuk max tamponu ile yıkayın ve canlı hücreleri sayın.

Önce CD 1 61 pozitif hücreleri seçmek için fakt boyama amacıyla bir alikot ayırın. Zenginleştirilmiş T hücrelerini 980 µL buz gibi soğuk max tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri 10 µg anti CD 1 61 monoklonal antikor ile 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri yıkadıktan sonra pelletini 800 µL max tampon çözeltisi ve 200 µL anti-US IgG 1 mikroboncukları ile yeniden konstitüe edin.

Bu çözeltiyi 4 °C'de 10 dakika daha inkübe edin. Hücreler mikroboncuklarla inkübe olurken, bir LS kolonunu dengelemek için 3 mL max buffer ekleyin. Bu hücre fraksiyonunu yıkadıktan sonra, 3 mL max buffer içindeki hücreleri yavaşça pipetle kolona aktarın.

Şimdi kolonu üç mililitre taze max buffer ile üç kez durulayın. Ardından kolona üç mililitre daha taze max buffer ekleyin ve kolonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Saflaştırılmış CD161 pozitif CD3 pozitif hücreleri tüpe boşaltın ve ardından NKT hücresi zenginleştirilmiş fraksiyonu sayın.

Bu adıma, zenginleştirilmiş 10⁶ CD161 pozitif CD3 pozitif T hücresini ve 10⁶ AAPC'yi 16 ml komple besiyeri plakasında birlikte kültüre ederek başlayın. Ko-kültürden kuyuk başına 160 µL'yi, düşük buharlaşma kapaklı, doku kültürü ile işlenmiş polistiren U tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. 12. ila 14. günlerde hücreleri hasat edin ve sayın. Popülasyonları akış sitometrik analiz ile analiz edin, ardından tekrar plakaya aktarıp ko-kültür yapın.

Az önce gösterildiği üzere, genişletilmiş NKT hücrelerinden ikinci genişletme turu sonrası artanlar dondurulur. A APC hücrelerinin fonksiyonelliğini test etmek için, öncelikle 96 kuyucuklu U tabanlı bir plaka içerisinde, her kuyucuğa 5x10⁴ NKT hücresini 5x10⁵ A APC ile 200 µL nihai hacimdeki komple ortamda birlikte kültüre edin. 24 ila 48 saat sonra, ELISA ile analiz etmek üzere hücre kültürü süpernatanını toplayın. Bu ilk şekil, burada gösterildiği gibi CD1D IG proteinlerinin manyetik boncukların yüzeyine stabil bir şekilde immobilize edildiğini kanıtlamaktadır.

Bu grafikte gösterildiği üzere, hem CD 1D IG hem de anti CD 28 antikorları manyetik boncukların yüzeyinde eksprese edilmiştir. V alpha 14 pozitif fare NK T hücresi hibridoması DN 30 2D three, ya ortamda çözünür alpha galera antijeni yüklenmemiş A A PC ile ya da alpha gal yüklü A A PC ile birlikte kültürlenmiştir. Daha sonra kültür süpernatantları toplanmış ve IL two üretimi Eliza ile ölçülerek antijen sunan hücrelerin her bir lotunu test etmek için basit bir yöntem sağlanmıştır. Bu deneyde, insan CD 1 61 pozitif CD three pozitif periferik kan T hücreleri manyetik boncuk ayrıştırması ile zenginleştirilmiştir.

Hücreler daha sonra 14 gün boyunca haftada bir kez alfa galera yüklü A A PC ile stimüle edilmiş ve V alpha 24 ile V beta 11 ekspresyonu açısından analiz edilmiştir. Önemli bir bulgu olarak, %0,03 gibi nispeten düşük bir başlangıç NKT hücresi popülasyonu ile bile hücrelerin yaklaşık %67'lik V alpha 24 pozitif V beta 11 pozitif bir popülasyona kadar genişletilebildiği görülmüştür. Burada, C one R CD 1D hücreleri, Alpha Gal SER antijeninin varlığında veya yokluğunda, 96 kuyucuklu U tabanlı plakalarda 20 ila 24 saat boyunca belirtilen oranlarda NKT hücreleri ile inkübe edilmiştir.

B hücreli lenfoma hattının NKT hücreleri aracılı hücre lizisi daha sonra kromyum salınım testi ile değerlendirildi. PC ile genişletilmiş NKT hücreleri bu lenfoma hücre hattını liz etmekte başarılı oldu. Alfa-galaktosilseramid varlığında veya yokluğunda, hem sağlıklı gönüllülerin hem de kanser hastalarının PBMC'lerinden NKT hücreleri genişletilmiş ve alfa-galaktosilseramid ile yüklenmiştir.

A PC, her iki gruptan NKT hücresi popülasyonlarını genişletebilmiştir. 2 milyon CD161 pozitif CD3 pozitif T hücresinden oluşan bir başlangıç popülasyonu kullanıldığında, iki tur genişletme sonrası 10⁷'den fazla hücre elde edilebilir. Genişletilmiş NKT hücreleri, burada gösterildiği gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir.

Ex vivo genişletilen NKT hücreleri, Alpha GAL stimülasyonuna yanıt vermeye devam eder ve IL 17 A, TNF alpha ve interferon gamma'nın güçlü üreticileri olurlar. Başlangıç T hücresi zenginleştirme popülasyonunun düşük olması ve ikinci CD 1 61 zenginleştirme adımının gerçekleştirilememesi durumunda, A A PC aracılı genişletmenin beklenen sonuçları vermeyebileceği unutulmamalıdır. Bununla birlikte, dolaşımdaki NKT hücrelerinin yüzdesi %0.1'den yüksekse, invariant NKT hücrelerinin anlamlı bir genişletilmesi hala elde edilebilir.

Toplu olarak bu veriler, CD 1D tabanlı A A PC'nin, bu prosedürü takiben primer insan NK T hücrelerini etkili bir şekilde genişletmek ve stimüle etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. NK T hücresi aktivasyonunun kinetiği nedir gibi ek soruları yanıtlamak için QPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, hepatoloji alanındaki araştırmacıların yağlı karaciğer hastalığında NKT hücrelerinin rolünü keşfetmelerine olanak tanımaktadır.