Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

Bu antijen güdümlü kolit modelinin genel amacı, antijene özgü kolit sırasında CX3, CR1 pozitif mononükleer fagositlerin CD4 pozitif T hücreleri ile etkileşime girip girmediğini ve aktive edip etmediğini ve bu mononükleer fagosit bağımlı efektör T hücresi genişlemesinin bağırsak lamina propria içinde gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemektir. Bu yöntem, antijen sunan hücreler ve kolon lamina propriasındaki efektör T hücreleri arasında ne tür etkileşimlerin meydana geldiği gibi inflamatuar bağırsak hastalığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bağışıklık hücrelerinin etkileşiminin ve inflamatuar bağırsak hastalığının patojenliğine yol açan unsurların incelenmesine izin vermesidir.

Bu yöntem, kırmızı floresan antijene özgü naif CD4 T hücrelerinin, mononükleer hücrelerde yeşil floresan proteini eksprese eden immün yetmezlik konağına aktarıldığı T hücresi transfer kolit modelini kullanır. Hücre transferini, mavi floresan antijen eksprese eden bakterilerin oral gavajı takip eder. Konakçıların bağırsak lamina propriasında meydana gelen immün olaylar, hastalık gelişiminin çeşitli aşamalarında izlenebilir.

Kolonu uzunlamasına açmak için diseksiyon makası kullanın ve herhangi bir kalıntı ve mukusu temizlemek için dokuyu 25 mililitre PBS içeren bir petri kabında yıkayın. Kolonu beş ila sekiz milimetrelik parçalar halinde kesin ve elde edilen parçaları, on milimolar HEPES ve beş milimolar EDTA ile desteklenmiş, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 20 mililitre taze DPBS'ye yerleştirin. Numune ile tüpü maksimum hızda 30 saniye boyunca vorteksleyin.

Ardından, epiteli çıkarmak için hafifçe sallayarak 37 santigrat derecede on dakika inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, 30 saniye boyunca tekrar girdap yapın. Ardından, epitel hücrelerini içeren süpernatanı atın.

Doku parçalarını 20 mililitre taze PBS, HEPES ve EDTA tamponu içeren yeni bir tüpe aktarın ve inkübasyonu önce ve sonra girdap adımlarıyla tekrarlayın. Üçüncü tekrardan sonra, tüm epitel hücreleri çıkarılır ve süpernatan berraktır. Kalıntı epitel hücrelerini çıkarmak için doku parçalarını PBS'de nazikçe yıkayın.

Doku parçalarını ikiye iki milimetrelik parçalar halinde kesin ve parçaları, mililitre başına 0.5 miligram kollajenaz tip sekiz ve mililitre DNAse başına on birim ile desteklenmiş on milimetre RPI ortamında sindirim için aktarın. Örnekleri 30 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, doku parçalarını 30 ila 35 dakika çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin ve inkübasyon sırasında her beş dakikada bir tüpü girdap haline getirin.

Doku sindirildiğinde, elde edilen bulamacı 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün. Hücre süzgecini bir kez yıkayın ve tek hücreli süspansiyonu santrifüjleme ile döndürün. Son olarak, hücreleri PBS ve santrifüjde bir kez yıkayın.

Ardından, tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Camgöbeği floresan proteini ovalbümin proteini üreten e. coli, e'nin aksine in vitro olarak OT-II hücrelerinde interferon gama üretimini aktive eder.

sadece CFP'yi ifade eden koli. E. coli PCFP ova ile beslenen transgenik yeşil floresan protein eksprese eden farelerin kolon dokusunun ex vivo 3D konfokal görüntülemesi, bağırsak epitel hücrelerinin yakınındaki kolon kriptleri içinde ve konakçı bağırsak fagositleri ile birlikte lokalize floresan protein eksprese eden bakterilerin varlığını gösterir.

OT-II kırmızı hayvanlarda, CD4 pozitif T hücreleri, kırmızı floresan proteini ve V beta beş nokta birin birlikte ekspresyonu ile karakterize edilir. E. coli PCFP ova ile mücadele edildiğinde, OT-II kırmızı CD4 pozitif CD62 ligand pozitif T hücreleri ile evlat edinilmiş olarak nakledilen BNT lenfosit eksikliği olan yeşil floresan protein eksprese eden transgenik fareler hızla vücut ağırlığını kaybeder ve klinik kolit belirtileri geliştirir.

Hücre transferinden yedi gün sonra, sadece birkaç konak fagositi örneklendi e. coli, PCFP ova ve OT-II kırmızı pozitif hücreler tespit edilmedi. Hücre transferinden 14 gün sonra, e'yi örnekleyen konakçı fagositler.

coli PCFP yumurtaları, evlat edinilmiş olarak transfer edilen OT-II kırmızı pozitif hücrelerin yakınında bulunur. Hücre transferinden 21 gün sonra, çok sayıda konak hücre, kolon lamina propria boyunca dağılmış olarak bulunan e. coli PCFP ovasını örneklemiştir ve donör OT-II kırmızı pozitif hücreleri, konakçı bağırsak fagositleri ile yakın temas halindedir.

Ustalaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, CD4 T hücrelerinin aktivasyon durumu hakkında ek soruları yanıtlamak ve kolitin ciddiyetini doğrulamak için bağırsak lenfositlerinin boyanması ve serum sitokin analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Her gelişmeden sonra, bu teknik, fare modelinde inflamatuar bağırsak hastalığına yol açan küçük olayları keşfetmek için immünoloji ve alanındaki araştırmaların önünü açar.

Bu videoyu izledikten sonra, aşağı akış ex vivo analizi için kolon lamina propria bağışıklık hücrelerinin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.