İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila'da uyku ve bağışıklık fonksiyonlarını değerlendirmektir. Bu öncelikle, uyku miktarını ölçmek için enfekte edilmiş sineklerin lokomotor aktivitesinin kaydedilmesiyle; ikinci adımda ise enfekte sineklerin homojenize edilip seyreltilerek LB agar plaklarına yayılmasıyla sağkalımın ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Üreyen koloni oluşturan birim sayısı, sineklerin enfeksiyonu temizleme yeteneğini gösterir.

Ardından, NF kappa b lüsiferaz raporlayıcısını içeren bir transjen eksprese eden enfekte sinekler, lüsiferazın substratı olan luciferian içeren 96 kuyucuklu bir plakaya eklenir. Kappa b Lüsiferaz'ın gerçek zamanlı ölçümü, enfeksiyon sırasında bir NF kappa B sinyal yolunun aktivasyonunu ve genel olarak uykuyla ilişkili sağkalım sonucunu gösterir. Bakteriyel temizlenme ve NF KB raporlayıcı aktivitesi, bağışıklık fonksiyonu ile davranış arasındaki moleküler bağlantıya dair mekanistik içgörü sağlayan ölçümlerdir.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan bireyler veya sineklere manuel olarak tutarlı bir şekilde nasıl enfeksiyon bulaştırılacağını öğrenmenin zaman ve pratik gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşarlar. Lucifer raporlu tekniğin QPCR gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, NF Kappa B aktivitesinin canlı sineklerde gerçek zamanlı olarak sürekli ölçülebilmesidir. Yetişkinlerin çevresel koşullara adapte olabilmesi için, geç pupa evresindeki drosophila kültürlerini üç ila dört gün boyunca inkube ederek başlayın.

Burada, sirkadiyen saatin bağışıklık yanıtı ve davranış üzerindeki etkisini ortadan kaldırmak için sinekler sabit ışık altına yerleştirilir. Ardından, bir ila dört günlük sinekler aktivite monitörlerine yüklenir. Monitörler, planlanan enfeksiyondan bir gün önce başlayarak, enfeksiyon öncesinde en az üç gün boyunca aktivitelerini kaydeder.

Steril bir pipet ucuyla tek bir SIA kolonisi seçin ve steril tekniğini doğrulamak için ucu beş mililitre LB medyumu içeren bir kültür tüpüne daldırın. Bakterisiz bir kontrol yalancı kültür hazırlamayı unutmayın. Bakterileri, ertesi güne kadar eksponansiyel büyüme evresine ulaşana dek gece boyunca büyütün.

Kültürün 600 nanometredeki absorbansını ölçün. İkinci bir Q vet'i kör olarak kullanın. Konsantrasyon 0,5 ile 1 absorbans ünitesi arasında olduğunda alt kültür için hazır hale gelir veya gerektiğinde kültür süresini uzatın.

Şimdi sinekleri enfekte etmek için bakteri çözeltisini hazırlayın. Bakterileri, 600 nanometrede 0,1 beklenen absorbansa ulaşana kadar PBS ile seyreltin. Ardından, enjeksiyon kontrolü için gıda boyası ekleyin.

Bakterileri LB besiyeri ile değiştirin. Her iki çözeltiyi de buz üzerinde saklayın. Ardından, bir mikro pipet çekici kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu altında ince uçlu enjeksiyon iğneleri hazırlayın.

Sinek üzerindeki hasarı minimize edecek kadar küçük, ancak vakumlama yoluyla enjeksiyon sıvısının doldurulabileceği kadar geniş bir açıklık oluşturmak için her bir iğnenin ucunu ince bir pens ile kırın. Bir cam iğneyi, bir uzunluktaki tüp yardımıyla üç cc'lik plastik bir şırıngaya bağlayın. Enjeksiyon ortamının akışı manuel olarak kontrol edilir.

Enjektör düzeneği hem enfeksiyöz hem de kontrol enjeksiyonları için kullanıldığından, kauçuk tüplerin enjeksiyon sıvısıyla kontamine olmasından kaçının. Enjeksiyon ortamının akışını bir Kim wipe mendil kullanarak doğrulayın. Başarılı enjeksiyonlar için iki kritik detay, optimal iğne boyutunun kullanılması ve iğne ile şırınga arasındaki sızdırmazlığın sağlanmasıdır.

Enjeksiyon sistemi tamamen hazırlandığında, sinekleri düşük akışlı karbondioksit kullanarak anesteziye alın; hiçbir sineğin beş dakikadan daha uzun süre anestezi altında kalmaması için işlemleri hızlıca gerçekleştirin. Ardından, cam iğneyi dorsal toraksın scutellum bölgesinin üst kısmına batırarak sineklere enjeksiyon yapın. Enjeksiyon ortamının sineğe geçişi, enjekte edilen solüsyon yayıldıkça görülebilen gıda boyası ile doğrulanır.

Başlamadan önce, bu prosedür için kullanılan tüm malzemelerin en az bir gün öncesinden otoklavlandığından emin olun. LV agar besiyeri ile 10 santimetrelik petri kaplarını hazırlayın. Deney gününde, sinekleri anestezi altına alarak 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine yerleştirin.

Her bir deneysel koşul için, her birinde en az 10 sinek bulunan minimum iki grup hazırlayın. Özellikle antibiyotik direnci olmayan bir bakteriyel suş kullanırken, enfeksiyon uygulanmamış bir kontrol grubu sinekler de hazırlayın. Yükleme yapılmış tüm tüpleri buz üzerinde saklayın.

Ardından, yüklü sinek tüplerinin her birine 400 µL LB besiyeri ekleyin. Kontaminasyonu önlemek için alev yakınında, küçük bir pestel kullanarak sinekleri homojenize edin. Şimdi, kesilmiş pipet uçlarını kullanarak homojenatı 200 µL'lik hacimlerde 10 kat seri dilüsyona tabi tutun.

Homojenat, sia enfeksiyonundan hemen sonra hazırlanmışsa seyreltmeyi 1:1000'e kadar yapın; ancak enfeksiyondan 24 saat sonra hazırlanan homojenat için seyreltmeyi 1:100.000'e kadar yapın. Ardından, eşit bir dağılım sağlamak için cam bilyeler kullanarak en yüksek iki seyreltmeyi 10 santimetrelik plakalara ekleyin ve plakaları gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plakalardaki koloni sayılarını doğrudan gözlem yoluyla veya koloni sayma yazılımı aracılığıyla sayın.

Ardından, sinek başına düşen koloni oluşturan birim sayısını hesaplayın. Bu analiz, uygun zamanda kappa b lusiferaz raporlayıcısını taşıyan transgenik sinekler kullanır. Analiz ayrıca, önceki bölümde açıklandığı şekilde enjeksiyon için hazırlanmış SCIA gibi kültürlenmiş bakteriler gerektirir.

Sinekleri deneysel aydınlatma koşullarına adapte edin. Bu örnekte, bir ila dört günlük kappa b luciferase sinekleri %5 sükroz ve %2 agar içeren besiyeri bulunan viallerde tutulur ve iki gün boyunca sabit ışığa maruz bırakılır. Şimdi sinekler için bir 96 kuyucuklu mikroplaka hazırlayın.

Her bir kuyucuğu iki katman gıda ile doldurun. Önce orta katman için, her birine 300 µL %5 sükroz, %2 agar çözeltisi ekleyin. Plakayı ince gözenekli bir bezle örtün ve plağın bir saate kadar iyice kurumasını bekleyin.

Ardından, her kuyucuğa %5 sükroz, %1 agar ve iki milimolar Lucifer içeren 50 µL'lik bir üst katman ekleyin. Lucifer ışığa duyarlı olduğu için plakayı karanlıkta kurumaya bırakın ve bundan sonra plakanın ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

Agar soğuduktan sonra, plağı şeffaf yapışkan bir filmle kapatın. Ardından ince bir iğne kullanarak, her kuyucuğun üzerindeki filmi iki kez delin. Bu delikler hava alışverişini ve gazla anesteziyi sağlar.

Ardından, sineklerin yerleştirilmesini kolaylaştırmak için keskin bir bıçak ve düz bir kenar kullanarak her sütun arasına bir kesik atın. Sinekleri karbondioksit ile anestezi edin ve her bir kuyucuğa sütun sütun, tek tek yerleştirin. Bir sinek filme yapışırsa, müdahale etmeden önce kendi başına kurtulması için ona fırsat tanıyın.

Mikro kuyucuklu plakayı, sabit ışık altında sekiz ila 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Kuyucuklara hapsolmuş sinekleri anestezi altına almak için, düşük basınçlı karbondioksit hattına bağlı bir mikro pipet ucu kullanın. Gazın zararsız düzeyde düşük basınçta olduğundan emin olun ve sekizerli gruplar halindeki sinekleri tek tek anestezi altına almak için mikro pipet ucunu doğrudan havalandırma deliklerinin üzerine yerleştirin.

Her bir sineği bir CO2 pedine aktarın ve daha önce yapıldığı gibi bakterilerle enfekte edin. Ardından her sineği orijinal kuyucuğuna geri koyun ve mikroplakayı yeniden mühürleyin. Sıcaklık kontrollü bir odada, belirlenmiş bir aydınlatma programı altında, bir lüminometre kullanarak her bir sinekteki lüminesansı ölçün.

Sineklerin bulunduğu plakaların şeffaf boş plakalar arasına yerleştirildiğinden emin olarak plakaları istifleme kasetine yükleyin. Luminometreyi üretici spesifikasyonlarına göre programlayın ve minimum 24 saat boyunca her saat başı okumalar toplayın. Bu örnekte, dedektörler her kuyucuğu 10 saniye boyunca okuyacak şekilde programlanmıştır.

İşlem tamamlandığında, veri dosyalarını bir hesap tablosuna aktarın ve sonuçları grafikleyerek standart bir analiz gerçekleştirin. Örnek veriler analiz edilebilir. Kuyu başına üç okumadan ortalaması alınan saniye başına düşen indirimler.

Canton S yabani tip sinekler ve NF kappa B geni eksik olan relish. E 20 mutant sinekler, sabit ışık altında iki aktivite monitörüne yerleştirilmiş ve sia ile enfekte edilmiştir. Bu örnekte, enfeksiyon uykuyu teşvik etmiştir.

Relish E 20 mutantlarının, enfeksiyondan sonra Canton s. kontrol sineklerine göre daha az uyudukları açıkça görülmüştü. Önceki bulgularla uyumlu olarak, relish E 20 mutantları ayrıca yabani tip sineklere kıyasla enfeksiyon nedeniyle hızla can verdi.

Sineklerin çoğu aseptik kontrol enjeksiyonundan sağ kurtuldu; bu durum, sineklerin enjeksiyona bağlı yaralanmadan değil, enfeksiyondan dolayı öldüğünü göstermektedir. Relish mutantları çok hızlı öldüğü için, enfeksiyon sonrası bakteriyel yükü göstermek amacıyla sadece Canton s sinekleri kullanılmıştır. Sia, enfeksiyondan 24 saat sonra sinek içerisinde çoğalmaya devam etmiştir.

Lusifer raporlayıcı aktivitesi, bireysel sinekler arasında ve veri noktalarının başarısı arasında geniş bir varyasyon gösterdi. Sinyal sineğin içindeki tüm dokulardan kaynaklansa da, her dokunun aynı miktarda sinyal yayması beklenmez ve sinek hareket ettikçe dokunun detektör tarafından görünürlüğü değişkenlik gösterir. Bu örnekte, sinekler enfekte edilmiş ve işlem görmüş bir kontrol grubuyla karşılaştırılmıştır.

Sinek grubu genelinde ölen sinekler analiz dışında bırakılmıştır. Kappa b Luciferase reporter aktivitesi enfeksiyondan sonra sürekli olarak artmaktadır. Kappa b Luciferase reporter aktivitesi aseptik yaralanmadan sonra da sürekli artış göstermiştir.

Zirve aktivite hem yaralanma sonrası hem de enfeksiyon sonrası için yaklaşık 12 saat civarındaydı. Bu videoyu izledikten sonra, enfeksiyon sonrası SSO'da bağışıklık fonksiyonunun ve uykunun nasıl nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uyku, sağkalım, süre, bakteriyel temizleme ve bir transkripsiyon raporlayıcısının gerçek zamanlı aktivitesini ölçebiliriz.