Bu prosedürün genel amacı, patch clamp kayıtları gerçekleştirmek için sıçan beyninden F1 F sıfır APA veziküllerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle beynin sıçandan çıkarılması ve homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, basınç uygulayarak sinaptik bölgelerin parçalanmasıdır.

Ardından, sinaptozomlar flakon gradyanları üzerine katmanlanır. Son adım, patch clamp kaydı için nihai vezikülleri elde etmek amacıyla digitonin ve L ile inkübe etmektir. Mitokondrilerin önemli bir işlevi, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimidir.

ATP üretiminden sorumlu olan enzim, mitokondri iç membranında yer alan ATP sentazdır. ATP sentaz fonksiyonunu ayrıntılı olarak incelemek için, SMV'ler olarak adlandırdığımız özel submikondriyal veziküller izole ederiz. Bunlar, ATP sentaz enzimini ters yüz edilmiş bir konfigürasyonda içerir.

Ardından bu SMV'leri bir patch clamp elektrodu ile kaydeder ve membranlarının sızıntılılık düzeyini belirleriz. Bu durum, mitokondriler tarafından gerçekleştirilen TP üretiminin verimliliği hakkında bize bilgi verir. Bu prosedürü bugün, Yale Üniversitesi'ndeki laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Sylvia ti gösterecektir.

Bu prosedürde, bir sıçanın başı dekapi̇tasyon yoluyla alındıktan sonra, kafatası açığa çıkarılacak şekilde deri kesilir ve ardından kafatası bir makas veya Rons ile nazikçe kesilerek açılır. Sonrasında beyin çıkarılır, cerebellum hariç beyin dokusu küçük parçalara ayrılır, nihayetinde izolasyon tamponuna alınır ve ardından beş mililitrelik cam Teflon homojenizatöre aktarılarak doku 10 kez, toplamda yaklaşık beş dakika boyunca nazikçe homojenize edilir. Bundan sonra örnek, bir masaüstü santrifüjde dört derece Celsius'ta 1.500 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjlenir.

Mitokondri ve sinaptozom içeren süpernatantı saklayın ve peleti atın. Ardından, örneği bir masaüstü santrifüjde 4 °C'de, 10 dakika boyunca 16.000 ×g hızında tekrar santrifüjleyin. Daha sonra süpernatantı atın ve peleti 500 µL izolasyon tamponunda yeniden süspande edin; bir hücre parçalama kabı kullanarak 1.200 PSI basınç uygulayarak 10 dakika boyunca sinaptozomları parçalayın ve ardından hızlıca basıncı düşürün. Parçalanmış sinaptozomları, iki katman oluşturacak iki farklı Ficoll konsantrasyonu içeren santrifüj tüplerinin üzerine katmanlar halinde ekleyin.

Ardından tüpleri bir SW 50.1 rotoruna yerleştirin ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 126.500 ×g'de santrifüjleyin. Ultra santrifüjde, pelet saflaştırılmış mitokondrileri temsil eder. Flakonun farklı yoğunlukları arasındaki tabaka ise bozulmamış sinaptozomdur.

Ardından, pellet'i ayrı bir santrifüj işlemine tabi tutarak izolasyon tamponu ile yıkayın. Bir masaüstü santrifüj kullanarak 4 °C'de 10 dakika boyunca 16,000 ×g değerinde santrifüjleyin. Şimdi, mitokondrileri 200 µL izolasyon tamponu ve buna eş değer hacimde %1 digitonin karışımında resüspande edin.

15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Ardından, daha fazla izolasyon tamponu ekleyin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g'de santrifüjleyin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın, ardından pellet'i 200 µL izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin, 2 µL %10'luk Lu bra, PX karışımı ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Ardından, karışımı santrifüj tüplerindeki izolasyon tamponu üzerine katmanlar halinde ekleyin. Tüpleri bir SSW 50.1 rotoruna yerleştirin ve dört derece santigrat sıcaklıkta, bir saat boyunca 182.000 ×g hızında santrifüjleyin. Bir saatin ardından.

Final peleti, izolasyon tamponu içerisinde 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g kuvvetinde santrifüj ederek yıkayın. Tipik bir elektrofizyoloji düzeneği; bir amplifikatör, DigiData 1440 ile donatılmış bir PC bilgisayar, pClamp 10.0 yazılımı ile birlikte kullanılan bir analog-dijital dönüştürücü arayüzü, manipülatörler, bir mikroskop, bir titreşim izolasyon masası ve bir Faraday kafesi içerir. İlk olarak, bir flaming brown mikro pipet çekici kullanarak borosilikat cam kılcal tüpten bir pipet çekin.

Pipetin optimal direnci 80 ile 100 mega ohm arasında olmalıdır. Submitokondriyal vezikülleri fizyolojik bir hücre içi çözeltiye ekleyin. Ardından, bir patch clamp pipetini aynı çözelti ile doldurun.

Faz kontrast mikroskopisi altında vezikülleri görüntüleyin. SMV'ler oda sıcaklığında patch edildikten sonra mikroskopi işlemini gerçekleştirin. Membran potansiyeli, her periyot için 10 saniye boyunca -100 mV ile +100 mV aralığındaki voltajlarda tutulurken aktiviteyi kaydedin.

Kaydedilen veriler, amplifikatör devresi kullanılarak beş kilohertz'de filtrelenmiş ve Clamp Fit 10.0 yazılımı ile analiz edilmiştir. Bu şekil, sitozol ve mitokondriden hazırlanan lizatın blotunu göstermektedir. Üst panel, sitozolik protein GA dh'ye karşı bir antikor kullanılarak yapılan immünoblot'u göstermektedir.

Alt panel, mitokondriyal iç membran proteini Cox dört karşıtı bir antikor kullanılarak yapılan blotu göstermektedir. Burada, 1 mM ATP eklenmesi öncesi ve sonrası kaydedilmiş iki temsili patch clamp kaydı yer almaktadır. Tutma potansiyeli +70 mV'dur. Kesikli çizgi 0 pA değerini temsil etmektedir.

Her bir iz 10 saniye boyunca kaydedilir ve izler arasında 10 saniye bulunur. Burada, SMV'lerin varlığında ve bir TP'nin yokluğunda ve varlığında A CMA indikatörünün floresan yoğunluk değişimlerinin zamana bağlı örnek izleri gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, mitokondrilerin ve F1 FO 80 TP Sentetaz içeren alt mitokondriyal veziküllerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, ATP Sentetaz Kompleksinin kanal aktivitesini analiz etmek için vezikül membranında bir elektrot ile form I dirençli mühürlemenin nasıl yapılacağını anlamalısınız.