Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

Bu prosedürün genel amacı, bir CyTOF cihazının günlük kalibrasyonunun ve örnek analizinin doğru şekilde nasıl gerçekleştirileceğini göstermektir. İlk olarak, cihaz kurulur ve açılır. Ardından, cihaz ayarları maksimum sinyali alacak şekilde kalibrasyon için optimize edilir.

Cihaz artık örnekleri çalıştırmaya hazırdır. Son adımda, cihaz temizlenir ve kapatılır. Nihayetinde, belirli zaman gereksinimlerine göre optimal hücre verileri elde edilebilir.

Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Günlük kurulum, ayarlama ve temizleme prosedürlerinin kılavuzdan öğrenilmesi zordur; çünkü süreçte eş zamanlı olarak yürütülmesi gereken birden fazla yazılım adımı bulunmaktadır.

Uygun arka plan seviyeleri ve sinyal yoğunlukları hakkında bir fikir edinmek için deneyim kazanmanız gerekir. Deneye başlamadan en az 15 dakika önce CyTOF yazılım programını açın ve instrument setup seçeneğini belirleyin. Ardından card cage sekmesinde, sprey odası kılıfının 200 °C sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için heater on düğmesine tıklayın.

Şırınga pompasındaki şırıngayı, milli cube su ile doldurulmuş yeni bir şırıngayla değiştirin. Ardından, her porttan ikişer kez %5 Citron ile geri yıkama yaparak nebülizatörü temizleyin. Kalan Citron kalıntılarını gidermek için geri yıkama işlemini Milli Q su ile tekrarlayın.

Ardından, cihazın önündeki argon ışığının yanmasını sağlayacak şekilde argon gaz tankı valfini açın. Daha sonra nebulizörü taşıyıcı gaz girişine ve nebulizörü sıvı giriş borusuna bağlayın. Nebulizörün ucunu, cihaz kurulum penceresindeki RFG kontrol sekmesinde bulunan ısıtıcı kılıfın beyaz açıklığına yerleştirin.

Plazmayı başlat (start plasma) düğmesine, ardından tamam (okay) düğmesine tıklayın. Başlatma işlemi bittikten sonra, açılan pencerede tekrar tamam (okay) düğmesine tıklayın. Şimdi şırınga pompasını açın.

Enjektörü yeniden doldururken, hacim sayacını sıfırlamak için duraklatma düğmesi yerine durdurma düğmesine basın. Kütle sitometresini kalibre etmeden önce, cihazın 20 dakika boyunca ısındığından emin olun. Makine stabilize olduğunda, veri toplama ayarları penceresini açmak için veri toplama ayarları düğmesine tıklayın. Analitler sekmesinde.

İzotop seçim panelini açmak için periyodik tabloya tıklayın. Ardından, kılavuzda listelenen DVS sciences kalibrasyon çözeltisindeki izotopları seçin ve kaydet'e tıklayın. Sonrasında, okuma başına kütleler penceresini açmak için okuma başına izotoplar butonuna tıklayın.

Yeni bir sayı girip ardından enter tuşuna basarak darbeler sayısını seçin ve y eksenini yeniden ölçeklendirin. Şimdi, bir mililitrelik yeşil bir norm enjektör şırıngasını ayar çözeltisiyle doldurun. Numune port seçicisini load konumuna getirin.

450 µL ayarlama solüsyonu enjekte edin ve ardından seçiciyi enjekte konumuna getirin. Ayarlama solüsyonu izotopları bu ekranda çizgiler şeklinde görünmeye başlayana kadar bekleyin. Uçuş süresi 9.400 ile 9.800 bölgesi arasındaki sinyaller, argon gazındaki xenon izotoplarından kaynaklanmaktadır.

Şimdi okuma penceresi başına kütlelere geri dönün ve yeşil oynatma düğmesine tıklayın. Her renkli çizgi, analitler sekmesinden seçilen izotopları temsil eder. İzotop seviyeleri sabitlendiğinde, veri toplama ayarları penceresinin parametre sekmesindeki açılır menüden mevcut akımı ayarlayın.

Başlangıç penceresinde, bitiş için sıfır, bitiş için ise 10 girin. Adım değeri için 0,5 ve yerleşme süresi için 200 girin. Ardından kaydet'e tıklayın.

Ardından, okuma başına kütleler (masses per reading) penceresine geri tıklayın ve oynat düğmesine basın. İzotopların sinyallerinin nerede zirve yaptığını not ettikten sonra, cihaz kurulum penceresinin DAC kanal kurulum sekmesine gidin. Akım (current) kısmına kadar aşağı kaydırın ve izotop pik değerini girin.

Gerçek akım değerini ayarla (set actual current value) seçeneğine tıklayın ve ardından kaydedin. Sonrasında, açılır menüyü gaz oluşturma (make up gas) olarak değiştirin. Başlangıç penceresine 0.55, bitiş penceresine 0.95, adım değeri penceresine 0.05 ve yerleşme süresi penceresine 200 girin.

Kaydet'e tıklayın. Okuma başına kütleler penceresine dönüp tekrar oynat'a tıkladıktan sonra, x ekseni artık tamamlayıcı gaz akış hızını görüntüleyecektir. İzotop sinyallerinin tepe yaptığı değerleri not edin ve sona doğru GD 1 55 sinyalindeki hızlı artışı gözlemleyin.

Ardından DAC kanal kurulum sekmesine geri dönün. Makeup gaz bölümüne aşağıya inin ve yeni izotop pik değerini girin. Set actual current value seçeneğine tıklayın.

Ardından, istenen izotopun oksite oranını kaydetmek için tekrar kaydete tıklayın. İlk olarak, 450 µL'lik ikinci bir ayar çözeltisi enjeksiyonu yapın. Daha sonra parametre sekmesinde, açılır menüden zamanı seçin ve başlangıç penceresine sıfır, bitiş penceresine 10, adım değeri penceresine bir ve oturma penceresine 200 girin.

Okuma başına kütleler penceresinde oynat düğmesine tıkladıktan sonra, imleci kullanarak TM 1 69 veya TB 1 59 için daha yüksek değeri ve ayrıca GD 1 55 değerini okuyun. Şimdi numune döngüsü üzerinden üç mililitre Milli Q su, ardından 500 mikrolitre DVS yıkama çözeltisi enjekte edin. Kütle kalibrasyonu sekmesinde, çizgilerin şiddeti azalmaya başlayana kadar temizleme yıkamasının ilerlemesini izlemek için çalıştır'a tıklayın.

Ardından üç mililitre milli cube su ekleyin ve çizgiler arka plan seviyelerine düşene kadar izleyin. Ayarlama çözeltisi izotopları için az önce gösterilen örnek izotoplarını girerek başlayın ve ardından kaydete tıklayın. Sonrasında, veri toplama penceresini açın ve veri toplama ayarlarını örnek hacmine göre gerektiği şekilde değiştirin.

Örneğin, 450 µL'lik bir örnek örnek döngüsünü dolduracak ve hücre verilerinin elde edilmesindeki gecikmeleri tolere etmek için 600 saniyede çalışacaktır. Çalıştırmadan önce veri toplama gecikmesini en az 30 saniye ve detektör stabilite gecikmesini en az 20 saniye olarak ayarlayın. Hücre örneklerini milli cube su ile en az iki kez yıkayın ve ardından örneği mililitre başına maksimum 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin ve elde edilen hücre çözeltisini 35 µm'lik bir hücre süzgecinden filtreleyin.

Herhangi bir agregatı gidermek için. Şimdi mevcut örnek için yeni bir dosya adı girin. Tüm dosyaların E sürücüsüne kaydedilmesi gerektiğini unutmayın.

Ardından numune döngü valfini yükleme konumuna getirin, numuneyi enjekte edin, numune döngü valfini tekrar enjekte konumuna getirin ve ardından çalıştır'a tıklayın. Kazanım penceresinde, hücreler anlık görüntü penceresinde her bir dikey izotop kanalındaki yatay işaret toplulukları şeklinde temsil edilecek ve burada gösterildiği gibi saniyede 300 ila 500 hücre civarında en iyi çözünürlüğü sergileyecektir.

Numunenin veri toplama işlemi tamamlandığında bir açılır pencere görünecektir. Numune analizinin tamamlandığını onaylamak için tamam'a tıklayın ve ardından makineyi temizlemek ve numune taşınmasını minimuma indirmek için her numune arasında en az 500 µL MQ su enjekte edin. Kullanım sonrası, numune döngüsüne 450 µL yıkama solüsyonu enjekte edin. Serbest metal salınımını izleyin ve ardından arka plan çizgi seviyeleri elde edilene kadar yıkamayı takip ederek numune döngüsünü üç mL milli Q su ile yıkayın.

Ardından cihazı kapatmak için, enstrüman kurulum penceresinin RFG kontrolcü sekmesini seçin ve plazmayı durdur (stop plasma) seçeneğine tıklayın. İşlem tamamlandığında, kart kafesi sekmesi altındaki nebulizatörün çıkarılmasını öneren açılır pencerede tamam (okay) düğmesine tıklayın. Isıtıcıyı kapatın, argon beslemesi üzerindeki valfi kapatın ve ardından nebulizatörü püskürtme odasından çıkarmak için dikkatlice geriye doğru çekin.

Ardından, numune giriş tüpünü vidalarını gevşeterek çıkarın ve kenara koyun. Yardımcı gaz giriş bağlantısını hafifçe gevşeyene kadar sökün ve ardından nebülizörü çekerek çıkarın. Son olarak, daha önce gösterilen şırınga ve tüpü kullanarak nebülizörün her iki portunu %5 Citron ile temizleyin ve nebülizörü bir sonraki kullanıma kadar %5 Citron ile kaplı şekilde saklayın.

Kütle sitometresinin UE suyu ve DVS yıkama solüsyonu ile yeterince yıkanması, tüplere ve makinenin diğer parçalarına metal absorbsiyon seviyelerini düşürerek bu grafiklerde görülen arka plan gürültüsünün azaltılmasına yardımcı olacaktır. Macenta renkli çizgi ile temsil edilen hatalı ayarlama, koyu mavi çizgi ile gösterilen düzgün ayarlanmış örneğe kıyasla m artı 16'daki oksit oluşumunu önemli ölçüde artırmıştır. Bu durum, m'deki istenen sinyallerin hafifçe azalmasına ve m artı 16'daki istenmeyen arka plan girişiminin önemli ölçüde artmasına neden olur.

Numunelerin uygun şekilde yıkanması ve Milli Q suyu ile uygun şekilde seyreltilmesi, hız gereksinimi ile dengelenirken minimum arka plan ve maksimum hücre çözünürlüğü sağlayacaktır. Burada gösterilen temsili bir deneyden elde edilen verilere benzer şekilde, bu deneyde doğal bollukta lantanum 1 39 ODIUM bir 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 ve LUTETIUM 1 75 içeren polistiren boncuklar hücre kazanım modunda çalıştırılmıştır. Veriler FlowJo kullanılarak analiz edilmiş ve kırılmış boncuklardan kaynaklanan kalıntılar kapı ayarlarıyla (gating) dışlanmıştır.

Doğru şekilde ayarlanmış numunenin, koyu mavi çizgi ile temsil edilen dakikada 0,74 litrelik akış hızında olduğu belirlenmiştir. Bu akış hızında, daha düşük akış hızlarına kıyasla daha yüksek sinyal yoğunlukları gözlemlenmiş ve doğru şekilde ayarlanmış bu numunenin, yanlış ayarlanmış sinyallere göre M metal kütlelerinde daha yüksek sinyal, m artı 16 oksit kütlelerinde ise daha düşük sinyal verdiğinin görülmüştür. LANTHANUM 1 39 ve THULIUM 1 69 M Kütlesindeki sinyalin yakın plan görünümü burada gösterilmiştir.

Tamamlama gazı akış hızının LANTHANUM 1 39 sinyal yoğunluğunu, thulium 1 69 sinyal yoğunluğundan daha fazla etkilediğine dikkat edin. Bu grafikler, sırasıyla LANTHANUM 1 39 artı oh 16 ve thulium 1 69 artı oh 16 oksitlerine karşılık gelen m artı 16 oksit kütleleri 1 55 ve 180 5'teki sinyalleri göstermektedir. Lanthanum 1 39, thulium 1 69'dan daha kolay oksitlendiği için, tamamlama gazı akış hızının kütle 1 55 sinyalini, kütle 180 5 sinyaline göre çok daha fazla artırdığına dikkat edin.

Burada, m ve m artı 16 sinyal yoğunluklarının tamamlayıcı gaz akış hızına bağlı fonksiyonu gösterilmiştir. Dolu simgeler MASS M'yi temsil ederken, boş simgeler m artı 16 kütlesini temsil etmektedir; çizgilerin renkleri ise ilgili kütle M'ye karşılık gelmektedir. LANTHANUM 1 39 ve price ODIUM 1 41 sinyal yoğunluklarının tamamlayıcı gaz akış hızından yüksek derecede etkilendiğine dikkat edin. Hatta m artı 16 oksit kütlesinin, M kütlesinden daha fazla olduğu bir noktaya ulaşılabilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, CyTOF cihazını nasıl düzgün şekilde başlatacağınız, doğru şekilde kalibre edeceğiniz, ardından numunelerinizi nasıl analiz edeceğiniz ve son olarak günlük analizlerinizin sonunda cihazı nasıl uygun şekilde temizleyip kapatacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.