Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Bu prosedürün genel amacı, rekabetçi bir murin kemik iliği nakli modelinde donör hücre aşılamasını ölçmek için PCR tabanlı bir teknik uygulamaktır, bu, ilk olarak erkek donör hücreleri kullanılarak dişi alıcı farelerde kemik iliği nakli gerçekleştirilerek gerçekleştirilir. Daha sonra periferik kan, alıcı farelerden farklı zaman noktalarında toplanır ve genomik DNA izole edilir. Numuneler standart bir eğri için hazırlanır.

Son olarak, standart numuneler ve test numuneleri ile gerçek zamanlı PCR gerçekleştirilir. Sonuç olarak, bilinen bir erkek ve dişi DNA yüzdesi ile standart bir eğriye karşı hesaplama yoluyla dişi alıcı farelerde erkek donörden türetilmiş hücrelerin aşılanmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin akım sitometri bazlı bir yöntem gibi mevcut yöntemlere göre erkek avantajı, daha hassas, daha ekonomik olması ve örneklerin uzun süre saklanabilmesidir.

En önemlisi, tekniğimiz en çok ipten bağımsızdır ve donör hücreyi alıcı hücrelerden ayırt etmek için iyi tanımlanmış hücre yüzeyi işaretleyicisi gibi farelerin herhangi bir genomik arka planı için kullanılabilir FVB nj'yi ötenazi yaptıktan sonra, laminer akış başlığı altındaki erkek donör ve dişi fareler, femur ve tibia kemiklerini incelemek için küçük makas ve forseps kullanır ve bunları altı mililitre buz gibi soğuk içeren 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirir RPMI 1640, %5 ısı devre dışı bırakıldı. FBS, kas ve diğer dokuları çıkarmak için bir Kim mendili kullanır ve çanaktaki her bir kemik şaftının her iki ucunu da keser. Daha sonra kemiklerin ucunu, %5 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ile RPMI 1640 ile doldurulmuş üç cc'lik bir şırıngaya bağlı 23 gauge iğneye bağlayın ve iliği yıkayın.

Tekrarlanan aspirasyonlarla kemik iliği dokusunu ayrıştırmak için aynı iğneyi kullanın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 400 G'de beş dakika boyunca döndürün.Süpernatı çıkardıktan sonra, hücreleri bir mililitre oda sıcaklığında yeniden süspanse edin, kırmızı kan hücresi lizzi, tamponlayın ve beş ila 10 mililitre RPMI 1640 eklemeden önce beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. % 5 ısı ile inaktive edilmiş FBS hücreleri bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı yeni bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı yeni bir tüp. Hücreleri 400 G'de beş dakika boyunca döndürdükten ve süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet, hafifçe girdaplamadan sonra% 5 ısıyla inaktive edilmiş FBS ile 10 mililitre RPMI 1640'ta yeniden süspanse edilen kırmızı kan hücrelerinin tamamen çıkarıldığını gösteren kırmızı renkte olmamalıdır, bir hemo sitometreye küçük bir alikot ekleyin ve hücreleri sayın.

Kemik iliği nakli için rakip dişi hücrelerle beş ila iki oranında karışması gereken hücre hacmini hesaplayın. Hücreleri enjeksiyona hazırlamak için son bir adım olarak, donör ve rakip hücreleri karıştırın, hücreler PBS ile yıkanır ve PBS'de mililitre donör hücreleri başına beş kez 10 ila altıncı ve rakip hücreler için mililitre başına iki kez 10 ila altıncı son konsantrasyonda yeniden süspanse edilir, kemik iliği naklinden dört ila altı saat önce. Dişi alıcı fareleri sezyum 1 37 gama radyasyonu ile tek bir dozda 11 gri ışınlayın.

Işınlanmış dişi fareleri bir fare tutucusuna yerleştirin ve karışık donör ve rakip hücreleri kuyruk damarı yoluyla 0.1 mililitrelik bir toplam hacimde enjekte edin, böylece her fare beş kez 10 ila beşinci donör hücreleri ve iki kez 10 ila beşinci rakip kemik iliği hücreleri alır kan örnekleri almak için. Anestezi uygulandıktan sonra, fareler retroorbital kanama ile EDTA kaplı tüplere yaklaşık 50 mikrolitre kan toplar. Ayrıca yaşa uygun erkek ve dişi farelerden örnekler toplayın.

Denek farelerden ve farelerden genomik DNA'yı izole etmenin yanında. Standart eğri için, her kan örneğine yaklaşık 200 mikrolitre oda sıcaklığında RBC lizis tamponu ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Bir mililitre PBS ekleyin ve parçalanmış RBC'lerin çoğunu çıkarmak için aşağı döndürün.

Ardından, DNA'yı önceden izole etmek için bir kan DNA ekstraksiyon kiti kullanın ve elucian tamponunu 37 santigrat dereceye ısıtın. Verimi artırmak için her bir numunenin DNA konsantrasyonunu ölçün. OD iki 60'a iki 80 oranı 1.8 ila 2.0 arasında olanlar daha fazla analiz için kullanılır.

Standart bir eğri oluşturmak için, erkek ve dişi DNA'yı mikrolitre başına dört nanogram konsantrasyona seyreltin ve DNA karışımını bu yönergelere göre hazırlayın. Siber yeşil süper karışım reaktifini burada gösterilen primerler ve genomik DNA ile karıştırarak PCR reaksiyon plakasını ayarlayın. Her 20 mikrolitrelik reaksiyon, her bir primerden 400 nano molar ve üç kopya halinde çalışan beş mikrolitre kan hücresi genomik DNA'sı içerir.

Metin protokolünde bulunan koşullara göre PCR gerçekleştirin ve döngü eşiğini veya CT değerlerini elde edin. Delta CT'yi hesaplayın, CT miktarının ZY'nin kuvvetine çarpın, bir eksi CT'nin BCL'nin kuvvetine iki ve ZY bir ifade seviyeleri veya iki eksi delta CT'nin gücüne çarpın, üçlü ikinin ortalamasını delta CT'nin gücüne çizerek standart eğriler oluşturun, gösterilen doğrusal bir regresyon uydurması ile karışımdaki bilinen yüzde erkek DNA'sına. Burada, erkek DNA'sının yüzdelerine karşı delta BT'nin gücüne iki ortalama değerlerle çizilen standart eğri örnekleri verilmiştir.

Bu grafik, sırasıyla 78.5 ve 88.5 santigrat derecede lokalize edilmiş BCL iki ve ZFY bir amplikonlar için spesifik bir erime sıcaklığını içerir. BCL iki, her PCR reaksiyonunda toplam yüklü DNA miktarını normalleştirmek için bir referans gen olarak kullanılır. Her standart numune için BCL iki amplifikasyon eğrisi, erkek DNA konsantrasyonundan bağımsız olarak birbiriyle birleşir ve eşit miktarda yüklü DNA'yı gösterir.

Bununla birlikte, PIM TKO farelerinden alınan örnek hematopoietik kök hücrelerde artan miktarlarda erkek DNA ile sola göç eden ZFY bir amplifikasyon eğrileri, ölümcül şekilde ışınlanmış farelerin yeniden yapılandırılmasında kusurlara sahiptir ve beklendiği gibi PIM TKO hücreleri ile nakledilen alıcı fareler, vahşi tip hücrelerle nakledilen farelere kıyasla çok daha düşük bir erkek hücre yüzdesine sahipti. Yöntemimizi doğrulamak için, nakledilen dişi farelerde erkek donör hücre aşılamasını test ettik, nakil sonrası farklı zaman noktalarında vahşi tipten kemik iliği hücreleri alarak PIM üçlü nakavt veya TKO fareleri, her ikisi de altı haftada periferik kan ve 16 haftada kemik iliği örnekleri. Bu videoyu izledikten sonra analiz edildi.

Rekabetçi bir deniz kemik iliği nakli modelinde donör hücre aşılamasını ölçmek için PCR tabanlı yöntemin nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız.