Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

Bu videoda gösterilen deneyin genel amacı, antimikrobiyal peptit lyin'in farelerde dekstran sülfatla indüklenen kolitin hafifletilmesinde rol oynayıp oynamadığını değerlendirmektir. Bu, vahşi tip farelerden alınan kemik iliğinin ışınlanmış vahşi tip ve nakavt farelere; nakavt farelerden alınan kemik iliğinin ise ışınlanmış vahşi tip farelere enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Transplant edilen kemik iliği, alıcıda donör genotipinde yeni kan hücreleri üretecektir.

Ardından, kolit indüklemek için alıcı fareler dört hafta sonra dekstran sülfata maruz bırakılır. Başarılı transplantasyon akış sitometrisi ile doğrulanır ve kolonik doku hasarı histoloji ile değerlendirilir. Vahşi tip kemik iliği nakavt farelere transplant edildiğinde kolitin hafiflediğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Aksine, nakavt kemik iliği yabani tip farelere nakledildiğinde kolit kötüleşir. Bu yöntem, inflamasyon veya enfeksiyonda kemik iliği kaynaklı hücrelerden veya kemik iliği kaynaklı olmayan hücrelerden gelen gen ekspresyonlarının belirlenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yabani tip ve nakavt farelerin takip edilebilmesini sağlamak için bu deneyde C 57, black six, yabani tip ve C kaynaklı nakavt farelerin kullanılması önerilir.

Kemik iliği transplantasyonu sonrası donör hücreler. Yabanı tip fareleri temsil etmek için CD 45.1, nakavt fareler için ise CD 45.2 fareleri kullanın. Burada gösterilen şema deneysel düzeneği tanımlamakta olup her grup için beş donör fare ve 10 alıcı fare atanmıştır.

A ve B grupları için, kemik iliği yabani tip farelerden nakavt farelere nakledilecektir. A grubunda kolit indüklemesi yapılacak, ancak B grubunda yapılmayacaktır. C ve D grupları için kemik iliği nakavt farelerden yabani tip farelere nakledilecek ve sadece C grubunda kolit indüklemesi yapılacaktır. E ve F grupları için nakil yabani tipten yabani tipe, G ve H grupları için ise nakavttan nakavta gerçekleştirilecektir. Işınlanmış farelere transfer edilmek üzere donör kemik iliği hazırlamak için, sakrifiye edilen farelerin kemiklerinden kemik iliğini biyogüvenlik kabininde çıkararak başlayın.

Humerus, femur, tibia ve fibula kemiklerini, bağlı oldukları kas ve ligamanlardan arındırarak açığa çıkarmak için steril diseksiyon aletleri kullanın ve bunları bir Petri kabına aktarın. Kırmızı kemik iliğini göstermek için kemiklerin her iki ucunu da kesin. Ardından, kemiklerden birini pensle kavrayın.

Kırmızı kemik iliğini, üç mililitrelik şırınga ve 25 gauge iğneler kullanarak soğuk PBS ile başka bir petri kabına yıkayarak boşaltın. Ardından, daha fazla kemik iliği hücresi elde etmek için kemiği diğer uçtan yıkayarak boşaltın. Bu işlemi her bir kemik için tekrarlayın.

Yaban tipindeki ve nakavt farelerin kemik iliğini ayrı ayrı havuzlayın. Kırmızı kemik iliği tıkaçlarını, tekrarlayan aspirasyon ve püskürtme yoluyla parçalamak için 18 gauge yarım inç iğneli altı mililitrelik bir şırınga kullanın. Ardından, toplanan kemik iliğini 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir serolojik pipet kullanın.

Tüm kemik iliği aktarıldıktan sonra, kemik iliğini 4 °C'de, 740 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı atın ve peleti beş ila 10 saniye boyunca vorteksleyerek yeniden süspande edin. Pelete, donör fare başına beş mililitre 1X RBC lizis tamponu ekleyin, tekrar beş saniye boyunca vorteksleyin ve oda sıcaklığında tam olarak üç dakika inkübe edin.

Üç dakika sonra, lizizi durdurmak için her tüpe 20 mililitre soğuk PBS ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Ardından, içeriği 40 mikronluk bir hücre süzgeci aracılığıyla yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe dökün. Orijinal tüpü beş mililitre PBS ile durulayın ve çözeltiyi hücre süzgecine aktarın.

Akışı konik tüpte toplamaya devam edin. Ardından, hacmi PBS ile 50 mililitreye tamamlayın ve ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, bir hemositometre kullanarak tripan mavisi dışlama yöntemiyle canlı hücre sayısını belirleyin.

Hücre sayısı belirlendikten sonra, kemik iliği hücrelerini 4 °C'de 913 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra, toplam hücre sayısına bağlı olarak süpernatantı uzaklaştırın. Pelleti, 1 × 10⁸ hücre/mL olacak şekilde PBS içerisinde yeniden süspanse edin.

Kemik iliği hücreleri artık ışınlanmış alıcı farelere aktarılmaya hazırdır. Bu deney için kullanılan alıcı vahşi tip ve nakavt fareler, ekteki belgede açıklandığı üzere 1000 rad ile ışınlanmıştır; fareler patojenle arındırılmış bir tesiste yetiştirilmekte ve barındırılmaktadır. Işınlamadan dört ila 24 saat sonra, donör kemik iliğini enjekte etmek için alıcı fareleri bir ısıtma lambası altında, ısıtma pedleri üzerinde ısıtın. Bir alıcı fareyi sabitleyiciye yerleştirin, enjeksiyon bölgesini sterilize etmek ve kolay enjeksiyon için lokal vazodilatasyonu desteklemek amacıyla kuyruğunu %70 etanol ile silin.

28,5 gauge iğneye sahip bir insülin şırıngası kullanarak, her farenin kuyruk venine enjeksiyon sonrası 1 ila 200 µL içerisinde 1 × 10⁷ hücre enjekte edin. Enjeksiyonu takip eden ilk dört hafta boyunca fareyi, enjekte edilmiş en fazla üç diğer fareyle birlikte bir kafese yerleştirin. Enjekte edilen alıcı fareleri, sulfa trim antibiyotiği içeren su ile birlikte otoklavlanmış kafeslerde muhafaza edin.

Bu süreç, hayvanların bağışıklıklarını yeniden kazanmaları için zaman tanır; hijyeni korumak amacıyla her dört günde bir kafesler değiştirilmeli, antibiyotikli su ve yem yenilenmelidir. Işınlama ve kemik iliği transplantasyonundan dört hafta sonra, antibiyotiksiz normal suya geçilmeli ve farelerin normal bağırsak mikroflorasını yeniden kazanmaları için iki hafta daha bekletilmelidir. Kemik iliği enjeksiyonundan altı hafta sonra, kolit indüklemek için başlangıç vücut ağırlığı ölçülür.

Kolit deney grubundaki farelere içme sularında %5 dekstran sülfat verin. Beş gün sonra, dört fareden alınan periferik kanı heparin kaplı vakuteyner tüplerinde birleştirin ve buz üzerine yerleştirin. Ardından, 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde 300 mikrolitre kanı 300 mikrolitre hücre boyama tamponu ile birleştirin ve kanı, her birinde 100 mikrolitre olacak şekilde birden beşe kadar etiketlenmiş beş akış sitometrisi test tüpüne buz üzerinde paylaştırın.

Fareler sakrifiye edildikten sonra, vücut ağırlıklarını tekrar ölçün ve değişimi hesaplayın. Kolon dokularını diseke edin ve h ve d boyaması için formalin içerisine yerleştirin. Ardından, daha önce olduğu gibi kemik iliği hücrelerini elde edin.

Resüspande edilen kemik iliğini, her birine 100 mililitre gelecek şekilde bir ile beş arası etiketlenmiş beş mikro santrifüj tüpüne paylaştırın. Akış sitometrisi analizi hazırlığı için, ekteki belgede açıklandığı şekilde her bir tüp için antikor karışımını karanlıkta hazırlayın; bir numara ile etiketlenmiş kan ve kemik iliği örnekleri kontrol olarak kullanılacak ve boyanmayacaktır. İki numara ile etiketlenmiş kan ve kemik iliği örnekleri, fitzy izotip kontrolü, PE izotip kontrolü ve CD 16/32 bloklama solüsyonu ile boyanacaktır.

Bu izotip kontrolleri, primer antikorun örneklere bağlanmasının özgünlüğünü doğrulamak için kullanılır. Üç numara ile işaretlenen örnekler FZ CD 45.1 ve CD 16/32 ile boyanacaktır. Dört numara ile işaretlenen bloklama solüsyonu örnekleri CD 45.2 ve CD 16/32 ile boyanacaktır.

Bloklama çözeltisi. Tek renkli etiketleme, kanda veya kemik iliğinde donör veya alıcı hücrelerin varlığını ortaya çıkarabilir. Belirgin şekilde, beş numaralı etiketli örnekler CD 45.1, CD 45.2 ve CD 16/32 için boyanacaktır.

Buradaki çift renkli işaretleme, kandaki veya kemik iliğindeki donör ve alıcı hücrelerin göreceli oranını göstermektedir. İlgili örnek tüplerine beş µL antikor karışımı iki ve beş ekleyin. Ardından, ilgili örnek tüplerine üç µL antikor karışımı üç ve dört ekleyin.

Tüm tüpleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her tüpe iki mililitre XRBC lizis tamponu ekleyin. Ardından örnekleri karanlıkta, buz üzerinde 15 dakika daha inkübe edin.

Hücreleri 350 ×g'de, dört derece santigrat sıcaklıkta beş dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i karanlıkta 500 µL hücre boyama tamponu ile yeniden süspande edin. Ardından kısa bir süre vortexleyin.

Ardından, immün boyama yapılmış kan ve kemik iliği örneklerine akış sitometrisi uygulayın. Vahşi tip CD 45.1'i temsil etmek için FZ'yi ve nakavt CD 45.2'yi temsil etmek için PE'yi seçin. Akış sitometrisi sonuçlarını Flo Joe yazılımını kullanarak analiz edin.

Donör genotipinin kan ve kemik iliğinde baskın genotip olup olmadığını belirlemek için fit E'nin PE oranını veya PE'nin fit e oranını hesaplayın. Bu görüntü, normal histolojiye sahip kolonlar ile DSS koliti olan kolonların örnek h ve e görüntülerini göstermektedir. Histoloji görüntüleri, mukozal doku hasarına ve mukozal ile submukozal dokulara nötrofil infiltrasyonuna göre puanlanır.

Böylece, lyin proteininin kolitin önlenmesinde bir rol oynayıp oynamadığını test etmek için daha yüksek bir histoloji skoru, daha şiddetli kolite işaret eder. Kemik iliği, bu videoda açıklandığı üzere yabanıl tip ve nakavt fareler arasında değiştirilmiştir. Ardından histoloji değerlendirilmiş ve burada gösterildiği şekilde skorlanmıştır.

Nakavt fare kemik iliği ışınlanmış yabanı tip farelere aktarıldığında histoloji skorları anlamlı şekilde artmıştır. Aksine, yabanı tip kemik iliği nakavt farelere aktarıldığında skorlar anlamlı şekilde azalmıştır. Bu veriler, kemik iliği kaynaklı hücrelerden gelen endojen C'nin anti-inflamatuar etkilere sahip olduğunu ve koliti iyileştirdiğini göstermekte olup, bu farelerde transplantasyonun başarılı olduğunu doğrulamaktadır.

Transplantasyon sonrası farelerin kemik iliği ve kanı üzerinde akış sitometrisi de gerçekleştirilmiştir. Burada gösterildiği üzere, yabani tip kemik iliği Fitz CD 45.1 için güçlü boyanırken pe, CD 45.2 için boyanmamıştır; nakavt kemik iliği ise burada gösterildiği gibi PE için güçlü boyanmış ancak Fitz için boyanmamıştır. Ancak transplantasyon sonrasında, nakavt kemik iliği alan yabani tip farelerin hem kemik iliği hem de kanı PE için güçlü boyanmış fakat Fitz için boyanmamıştır; bu durum, boyanan hücrelerin hakim popülasyonunun donörden geldiğini göstermektedir.

Benzer şekilde, vahşi tip kemik iliği nakli yapılan nakavt farelerin kemik iliği ve kanında fitzy için güçlü boyanma görülürken pe için görülmemiştir; bu da boyanan baskın popülasyonların donör kaynaklı olduğunu bir kez daha doğrulamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kemik iliği transplantasyonu deneyini gerçekleştirebilmeli ve kemik iliği kaynaklı hücreler aracılığıyla koliti modifiye edebilmelisiniz.