Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, yüksek çözünürlüklü intra vital görüntüleme için standart bir iki foton mikroskobu hazırlamaktır. Bu, önce lazerlerin ayarlanmasını içeren mikroskobun hizalanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, ışın çoklayıcı, mükemmel ışın şekli ve ışın aydınlatmalı düzenleme elde etmek için hizalanır.

Çok ışınlı tarama durumunda, numunenin çizgili aydınlatma deseni ile taranmasıyla ham görüntüler elde edilir. Son olarak, yüksek çözünürlüklü nihai görüntüyü hesaplamak için bir algoritma uygulanır. Sonuç olarak, çizgili aydınlatma mikroskobu, daha önce intra vital mikroskopi ile erişilemeyen farelerin lenf düğümlerindeki germinal merkezlerdeki bağışıklık sistemi davranışının ayrıntılarını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin yapılandırılmış aydınlatma veya lokalizasyon mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, canlı örneklerde büyük doku derinliklerinde uygulanabilmesidir. Lazer ışını şeklinde herhangi bir değişiklik gerektirmez, bu nedenle yöntemi çok basit ve herhangi bir çoklu foton mikroskobuna uygulanması kolay tutar. Çok ışınlı iki foton çizgili aydınlatma mikroskobu için kullanılan kurulum, en düşük düzeyde fotoğraf ağartma ve en hızlı çekim ile optimum çözünürlük ve kontrast kalitesi elde etmek için burada gösterilmiştir.

Metin protokolünde belirtildiği gibi kurulumda ayarlamalar yapmayı düşünün. Ayarlamaları yaptıktan sonra, prizma tabanlı darbe kompresörünün ucundaki giriş aynasının hemen üzerinde bulunan aynaya ışının geri gelip gelmediğini kontrol edin. Buradan ışık yolu ayarlandıktan sonra, ışın ışın çoklayıcıya yansıtılır.

Çok ışınlı şeritli aydınlatma yapılıyorsa, tarayıcı kapalıyken çoklu foton mikroskobu yapın. Sahneye homojen bir şekilde floresan bir numune yerleştirerek ışın çoklayıcıdaki aynaları hizalayın ve lazer ışınını numunenin içinde, ancak üst yüzeye yakın bir yere odaklayın. Objektif ön merceğine yakın.

Mikroskobu çoklu ışın moduna ayarlayın ve ışın sayısını ve polarizasyonu seçin. Örneğin, floresan slaytı görüntüleyerek lazer ışınını bulmak için P, P deklanşörünü açık konuma getirin ve ışını odaklarken CCD kamerayı sürekli olarak çalıştırın ve ışının merkez konumda olduğundan emin olun. P ışınını hizalarken, 64 ışın moduna geçin ve ilgili deklanşörü açın.

Kirişin konumunu kontrol edin. Birinci ila beşinci ışın çoklayıcı aynalarının ayarlanması, ışın ışıklarının eşit uzaklıkta olduğundan emin olun. Çizgili aydınlatma algoritmaları bu varsayıma dayandığından, düzgün floresan numuneyi heterojen yapılı olanla değiştirin.

Örneğin, Conval alanı kök örneği alın ve çok ışınlı bir görüntüyü tarayın. Görüntünün keskin, düzgün ve düz göründüğünü kontrol edin. Heterojen numuneyi homojen numune ile değiştirin.

Tarama işlemini kontrol etmek için XY tarayıcıyı başlatın. Çok ışınlı tarama için çizgili görüntü uyarma deseni oluşturmak için. Y tarayıcı aynasını ışınla aydınlatılan çizgiye dik olarak hareket ettirin.

Dikdörtgen çizgili bir görüntü oluşturmak için burada blok kaydırma adı verilen X tarayıcı aynasını hareket ettirerek burada blok sayısı ile gösterilen oluşturulan deseni tekrarlayın. Heterojen örneği geri yerleştirin ve tarayıcıyı ana tetikleyici olarak kullanın. Çizgili görüntüleri tekrar tekrar elde etmek için çizgili bir görüntüyü otomatik olarak almak ve kaydetmek için kamerayı tarayıcıyla senkronize edin.

Burada yeterli tekrar adımını, burada kayma sayısını ve uygun adım uzunluğunu seçerek X tarayıcı aynasını farklı konumlara taşıyın. Ardışık iki ışın genişliği arasındaki mesafeyi kaplamak için sonraki iki çizgili görüntü arasındaki adımı kaydırın. X kaymasını, verilen uyarma dalga boyunda yanal çözünürlük sınırının altında bir değere ayarlayın.

Örneğin, X tarayıcı aynasının vardiya başına 10 adımını ve 12 veya 13 vardiyayı kullanmak, en iyi uzamsal çözünürlüğe yol açar. Konval alanı görüntüsü en keskin hale gelene kadar bu iki değeri optimize etmek için konvela alanı kök kayarıyla elde edilen sonuçlar. Geleneksel CCD görüntülerinde ve hesaplanan çizgili aydınlatma görüntülerinde çizgi profili aracını kullanın.

Bu örnekte conval Hücre duvarlarından gelen floresan sinyali olan çizgi profillerinin genişliğini karşılaştırın. Tarayıcı hareketiyle senkronize edilmiş her ham çizgili görüntüyü alın ve ayrı olarak, örneğin TIFF veya ikili dosyalara kaydedin. Yüksek çözünürlüklü çizgili aydınlatma görüntüsünün iki boyutlu bir matrisini oluşturmak için, değerlendirme rutininde matrisler olarak ham çizgili görüntülerden oluşan eksiksiz bir set açın.

Derin dokuda çizgili aydınlatma, çok ışınlı, çoklu foton mikroskobu gerçekleştirmek için daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi minimum maksimum algoritmayı veya Fourier dönüşümü tabanlı bir algoritmayı kullanın. Canlı organizmalarda, zaman içinde farklı doku derinliklerinde çizgili görüntüler elde edin ve germinal merkez, B hücreleri ve foliküler dendritik hücreler arasındaki dinamik etkileşimin yüksek çözünürlüklü bir 3D filmini oluşturmak için bunları daha önce açıklandığı gibi değerlendirin. Etkin nokta yayılma fonksiyonunun boyutları, bir mikroskobun uzamsal çözünürlüğüne karşılık gelir.

Bu üç boyutlu fonksiyonu, kollajen liflerinin ikinci harmonik üretim sinyalini veya mion lenf düğümlerinde 515 nanometrede yayılan 100 nanometre polistiren boncukların floresan sinyalini elde ederek ölçtük. Çok ışınlı çizgili aydınlatmamızı kullanarak, T-P-L-S-M, CCD kameralar aracılığıyla alan algılama, T-P-L-S-M, alan algılama gibi yerleşik iki foton lazer tarama mikroskobu tekniklerine kıyasla ve T-P-L-S-M. Bu ölçümlerden, numunenin yüzeyinde, hem yanal hem de eksenel çözünürlüklerin, kırınım teorisi tarafından tahmin edilen beklenen değerlere karşılık geldiği açıktır.

Bununla birlikte, artan görüntüleme derinliği ve dolayısıyla çok çeşitli kırılma indekslerine sahip ortam boyunca hem uyarma hem de emisyon radyasyonlarının artan optik yolu ile, uzamsal çözünürlük, kullanılan kurulumdan bağımsız olarak önemli ölçüde bozulur. Görüntüleme derinliğinden bağımsız olarak M-B-S-I-T-P-L-S-M kullanarak, yaklaşık %20 daha iyi yanal çözünürlüğe ve %220 daha iyi eksenel çözünürlüğe ulaştık. Standart T-P-L-S-M yaklaşımları ile karşılaştırıldığında.

Yetişkin farelerin sekonder lenfoid organları içindeki immün yanıt sırasında B hücrelerinin klonal seçimi, bellek B hücrelerine veya plazma hücrelerine farklılaşma yolundaki ilk adımdır. Bu süreçte, foliküler dendritik hücreler ile germinal merkezlerdeki immün kompleks yapılar düzeyindeki B hücreleri arasındaki oldukça dinamik etkileşimin merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Sadece yüksek çözünürlüklü bir intra vital mikroskopi teknolojisi kullanılarak, bu hücresel iletişimi ve foliküler dendritik hücreler üzerinde anti CD 2135 FAB ATO five 90 tarafından etiketlendiği gibi burada görülen bağışıklık tepkisi üzerindeki etkilerini incelemek mümkündür.

M-B-S-I-T-P-L-S-M, ilk kez, popal lenf düğümlerinin germinal merkezlerinde 120 mikron derinliğe kadar bağışıklık kompleksi birikintilerinin kümelerinin boyutlarını hayati olarak görselleştirme ve ölçme imkanı sağlar. Bu görüntüler, konvansiyonel PMT bazlı ve M-B-S-I-T-P-L-S-M tarafından elde edilen bir germinal merkezdeki immün kompleks birikintilerinin 3D floresan görüntüleri arasındaki doğrudan karşılaştırmayı göstermektedir. Ayrıca, immün kompleks birikintilerinin germinal merkez B hücreleri ile etkileşimleri yüksek oranda çözülebilir ve şimdi proliferasyon, farklılaşma veya apoptoz için intra vital fonksiyonel problarla kombinasyon halinde araştırılabilir.

Bu prosedürü denerken, kamera algılama tabanlı bir teknikle, yakalama hızının yaklaşık sekiz kat daha yüksek olduğunu, maksimum görüntüleme derinliğinin ise standart bir fotoçoğaltıcı tabanlı çoklu foton mikroskobu ile elde edilenlerden yaklaşık %25 daha düşük olduğunu akılda tutmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, mikroskop ışık yolunun ayarlanması, ışın latlarının hizalanması, tarama parametrelerinin hesaplanması ve nihai yüksek çözünürlüklü görüntünün hesaplanması dahil olmak üzere çok katlı mikroskobunuzu çizgili aydınlatma yöntemiyle çalışacak şekilde nasıl ayarlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. İntravital derin doku deneyleri için.