Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, mRNA'ların translasyonu ile ilişkili mitokondriyi izole etmektir. Bu, ilk olarak mitokondri zenginleştirme koşulları altında yetiştirilen maya hücrelerinin hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, siklo heide varlığında hücreleri nazikçe bitlemektir.

Daha sonra mitokondri, diferansiyel santrifüjleme ile çözünür bileşenlerden ayrılır. Son adım, mitokondri ve kontrol örneklerinden RNA'nın ekstraksiyonudur. Sonuç olarak, kuzey analizi, mitokondri ile ilişkili RNA'nın saflığını ve kalitesini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin temel avantajı, birçok RNA tipinin tek bir preparatta izole edilebilmesidir. Bu nedenle karşılaştırmalı bir analiz yapılabilir. Bu yöntem, hücre içi hedefleme ve organal fonksiyon gibi hücre biyolojisindeki temel soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu prosedürde mitokondri 100 ila 150 arasında saflaştırılacaktır. Fermente edilemeyen bir büyüme ile 30 santigrat derecede bir ila 1.5 arasında bir OD 600'e kadar büyüyen mililitre maya hücreleri. Orta. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3000 kez yerçekiminde santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti tekrar çift damıtılmış su santrifüjü ile yıkayın.

Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini tartın. Tipik olarak 100 mililitre hücreden yaklaşık 0.6 gram elde edilir. Resus, peleti 0.5 gram hücre başına bir mililitre DTT tamponunda askıya alır.

Hücre duvarı içindeki dis sülfür bağlarını kırmak için hücrelere bir indirgeyici ajan ile muamele etmek önemlidir, böylece hidrolizi iyileştirir, hücreleri hafifçe çalkalama ile 30 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3000 kez yerçekiminde santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti yeniden askıya alın.

0.15 gram hücre başına bir mililitre xmal liase tamponunda girdap olmaz. 990 mikrolitre su içinde 10 mikrolitrelik bir hücre alikotunun OD 600'ünü ölçün ve bu değeri kaydedin. Beta bir üç glukan bağlantısında glikoz polimerlerini hidrolize etmek ve Sphero plast oluşturmak için hücrelere taze hazırlanmış xmal liaz ekleyin.

Bundan sonra Spheroplast, lizizi önlemek için izotonik bir çözelti içinde tutulmalı, hücreleri hafifçe çalkalayarak 30 santigrat derecede 15 dakika inkübe etmelidir. Hücre duvarının ve plast üretim küresinin hidrolizini doğrulamak için, hücrelerin 10 mikrolitresini 990 mikrolitre su ile karıştırın ve OD 600'ü ölçün. Sphero platsın ozmotik fark nedeniyle bitlenmesi beklenir ve OD 600, xmal liaz eklenmeden önce belirlenen değerden en az on kat daha az olmalıdır. Değilse, 15 dakika daha xmal liase ile inkübasyona devam edin.

Plast'ın PHE'sini 100 mililitre geri kazanım ortamı ile yeniden askıya alın ve plast küresini bir Helen Meyer Şişesine aktarın. Çalkalayarak 30 santigrat derecede bir saat inkübe edin. XY tedavisi sırasında translasyon durdurulduğu ve mRNA lokalizasyonu bozulduğu için bu kurtarma adımı gereklidir.

Bir saat sonra mililitre başına 0.1 miligram, siklo heide ekleyin ve Sphero plast'ı önceden soğutulmuş 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Cyclo Heide baskısı, ribozomların mRNA'larla ilişkisini dondurmak için önemlidir. Böylece ribozoma bağımlı mRNA'nın mitokondri ile ilişkisi korunur.

Santrifüj, dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 3000 katı plass küresi. Süpernatanı atın ve iki kez soğuk mannitol ile yıkayın. Tampon reus.

Plass küresini dört mililitre soğuk manitol tamponu ile askıya alın ve süspansiyonu, sıkı oturan bir havaneli ile donatılmış 15 mililitre kapasiteli bir aşağı homojenizatöre aktarın. Plass küresini 15 vuruşla yavaşça kırın ve lizatı 13 mililitrelik bir tüpe aktarın. Lizatı dört santigrat derecede altı dakika boyunca yerçekiminin 1.500 katında santrifüjleyin.

Çekirdekleri ve kırılmamış hücreleri peletlemek için. Süper natini dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Numunenin bir mililitresini veya %25'ini fraksiyonlanmamış veya toplam numune olarak bir kenara koyun.

Bu numunenin 50 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın ve 15 mikrolitre dört XLSB ekleyin. Batı kan analizi için, kuzey ve mikrodizi analizleri için toplam numunenin geri kalanından RNA çökeltilecektir. Süper natini 10.000 kez santrifüjleyin.

Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca yerçekimi. Mitokondriyi peletlemek için süper natini yeni bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun. Bu sitozolik fraksiyondur.

Bu numunenin 50 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın ve 15 mikrolitre dört XLSB ekleyin. Western blot analizi için, kuzey ve mikrodizi analizleri için sitozolik numunenin geri kalanından RNA çökeltilecektir. Peleti üç mililitre mannitol ile yıkayın, tamponlayın ve 10.000 kez tekrar santrifüjleyin.

Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca yerçekimi. Reus, peleti üç mililitre mannitol tamponu ile askıya alır. Bu numune mitokondriyi içerir ve mitokondri fraksiyonu olarak adlandırılır.

Bu numunenin 50 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın ve Western blot analizi için 15 mikrolitre dört XLSB ekleyin. Bu prosedüre başlamak için, her numuneye bir hacim sekiz molar guad dium, HCEL ve iki hacim% 100 etanol girdabı ekleyin ve eksi 20 santigrat derecede en az iki saat inkübe edin. Numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yerçekiminin 10.000 katında santrifüjleyin.

Süpernatanı atın. Pelet kararsız olabileceğinden dikkatli olun. Peleti %70 etanol reus ile yıkadıktan sonra, peleti 400 mikrolitre RNA içermeyen su ile süspanse edin ve numuneyi yeni bir einor tüpüne aktarın.

0.1 hacim üç molar sodyum asetat pH 5.2 ve iki hacim %100 etanol girdabı ekleyerek RNA'yı tekrar çökeltin ve eksi 20 santigrat derecede en az iki saat inkübe edin. Numuneleri 20.000 kez santrifüjleyin. Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yerçekimi.

Süpernatanı atın ve% 70 etanol ile yıkayın. Peletleri havayla kurutun ve RNA'lar serbest su deposu RNA ile tekrar askıya alın. Eksi 80 santigrat derecede numuneler.

Numuneler daha sonra kuzey veya mikrodizi analizleri için kullanılabilir. RNA'yı mikroarray analizine hazırlamak için, önce guin HCL ve etanol çökeltmesinden elde edilen her bir MRNA peletinin 650 mikrolitre RNA serbest su ile tekrar süspanse edilmesi ve vidalı kapaklı bir orph tüpüne aktarılmasıdır. Daha sonra 650 mikrolitre asidik fenol kloroform ekleyin ve iki dakika boyunca maksimum hızda kuvvetlice santrifüjleyin.

Üst sulu fazın 500 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. DNA içerdiğinden interfazı almaktan kaçının. Ayrıca, ters transkripsiyon reaksiyonunu engelleyebilecek fenol almaktan kaçınmaya dikkat edin.

Lityum klorür çökeltme ile RNA örneğinden heparini çıkarın. İki molar nihai konsantrasyona lityum klorür ekleyin ve numuneleri ertesi gün eksi 20 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Numuneleri dört santigrat derecede çözün ve 20.000 kez santrifüjleyin.

Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yerçekimi. Süpernatanı dikkatlice atın ve peleti% 80 etanol santrifüj ile yıkayın. Yine, süpernatan havayı kurutun ve peleti yeniden süspanse edin 150 mikrolitre RNA serbest suda, kalıntı lityum klorürü çıkarmak için tekrar çökeltin, 0.1 hacim üç molar sodyum asetat pH 5.3 ve üç hacim% 100 Etanol eksi 20 santigrat derecede en az iki saat inkübe edin.

Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüjleyin. Şeffaf peleti %80 etanol ile dikkatlice yıkayın ve havayla kurutun. Son olarak, peleti 25 mikrolitre RNA serbest su ile tekrar süspanse edin ve numuneleri eksi 80 santigrat derecede tutun.

Bu protokolün, fraksiyon içeren bir mitokondriyi sitozolik bileşenlerden ayırmadaki başarısı, en iyi şekilde, farklı izolasyon adımlarından alınan numuneler üzerinde kuzey analizi ve Western analizi yapılarak test edilir. Bu örnekte, numuneler fraksiyonlamadan veya toplam fraksiyondan, sitozolik fraksiyondan ve mitokondriyal fraksiyondan önceydi. Aşağıdaki mRNA'lar, COB ve RNA için kuzey analizi yapıldı.

Bu, mitokondri, bir CO ve mitokondriye aktarılan bir proteini kodlayan MRNA içinde kopyalanır. Bir CT, sitozolik aktin proteinini kodlayan bir Mr.Nna ve SEC 61, bir ER yerleşik proteinini kodlayan bir M nna. Alt panel, 25 s ve 18 s olmak üzere iki belirgin RNA bandının tespit edildiği kuzey zarının metilen mavisi boyamasıdır.

COB mitokondri içinde kopyalandığından, sinyali yalnızca mitokondride olmalıdır. Bu çalışmada da görüldüğü gibi. Sitozolik fraksiyonda COB'nin ortaya çıkması, hazırlık sırasında mitokondri lizizini gösterecektir.

ACO one, mitokondriye aktarılan ve çoğunlukla mitokondriyal fraksiyonda görülen bir proteini kodlar. Bir CT, sitozolik bir proteini kodlar ve bu nedenle çoğunlukla sitozolik fraksiyonda görülür. Mitokondriyal fraksiyonda SEC 61'in varlığı, bu fraksiyonda ER bileşenlerinin varlığını gösterir.

RNA'ların sinyalleri her iki fraksiyonda da görülür ve ribozomların varlığını gösterir. Aşağıdaki proteinler, POR bir A mitokondri, dış zar proteini hx, K bir A, sitozolik protein CUE bir ve ER proteini ve RPL 39 için Western analizi yapıldı. Beklendiği gibi bir ribozomal protein POR bir sinyali sadece mitokondriyal fraksiyonda tespit edildi.

Sitozolik fraksiyonda bir POR sinyali tespit edilirse, hazırlık sırasında mitokondriyal bileşenlerin ayrışmasını önerecektir. Ayrıca, beklendiği gibi, hx K bir sadece sitozolik fraksiyonda tespit edildi. Mitokondriyal fraksiyondaki güçlü CUE bir sinyali, önemli miktarda ER ile ilgili materyalin mitokondriyal fraksiyonda birlikte izole edildiğini gösterir.

Bu, ER ve mitokondri arasındaki bilinen fiziksel temasların bir sonucu olabilir. RPL 39 sinyali her iki fraksiyonda da görünür, yine her iki fraksiyonda da ribozomların varlığını doğrular, prosedürden elde edilen geri kazanım adımı hariç, ribozomların M fraksiyonundan kaybolmasına neden olur, bu da mitokondri ile mRNA ilişkisini etkileyecektir. Mitokondriyal ve sitozolik bileşenler arasındaki ayrılma kalitesini doğrulamanın yanı sıra, numunelerdeki RNA veya proteinlerin sağlam olduğunu ve numune hazırlama sırasında ciddi RNA veya protein kaybı olmadığını doğrulamak önemlidir.

Bozulmamış, RNA ve proteinler, burada gösterildiği gibi analizlerde farklı bantlar olarak tespit edilmelidir. Mitokondriye aktarılan bir proteini kodlayan c CCP bir mRNA için, ek daha kısa bantların veya lekelerin ortaya çıkması bozulmayı gösterecektir. Ciddi kayıplar, birlikte ele alındığında, gözlemlenmeyen toplam ve göreceli sinyal miktarı arasında önemli bir farka neden olacaktır.

Bu sonuçlar, bu protokolün mRNA'ların, ribozomların ve proteinlerin tek bir prosedürde izolasyonu için etkili bir yöntem olduğunu doğrulamaktadır. Bu prosedürü takiben, organal fonksiyonların temel ve benzersiz özelliklerini belirlemek için RNA-Seq veya proteomik analiz gibi genom çapında yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, mitokondri ile ilişkili RNA'nın nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.