Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Bu prosedürün genel amacı, tek bir DNA bağlayıcı protein ile bir DNA molekülü arasındaki dinamik etkileşimi gözlemlemektir. Bu, özel yapım bir mikroskopta, iki tek molekül tekniğinde, çift optik cımbızda ve floresan mikroskobunda birleştirilerek elde edilir. Bu kurulum aynı zamanda numunenin görselleştirilmesi ve nanometre stabilizasyonu için parlak alan aydınlatması ile donatılmıştır.

İkinci adım olarak, bir mikro akış sistemine entegre edilmiş çok kanallı bir akış hücresi, deney için gerekli tüm bileşenleri verimli bir şekilde işe almak ve bir araya getirmek için dört adede kadar laminer akışa izin verecek şekilde inşa edilmiştir. Daha sonra, deneyleri gerçekleştirmek için tek molekül yapısı bir araya getirilir. İlk iki şerit titin kaplı mikro kürecik, ilk kanaldaki çift optik cımbız ile yakalanır.

Sıkışan iki boncuk daha sonra her iki ekstremitede biyotin ile etiketlenmiş DNA şablonunun bağlanmasına izin vermek için ikinci kanala taşınır. Tek bir DNA molekülünün varlığı, üçüncü kanalda A DNA kuvvet uzatma analizi ile kontrol edilir. Son olarak, DNA dambıl adı verilen boncuk DNA boncuk yapısı, floresan etiketli laktoz baskılayıcı proteinin bulunduğu protein kanalına taşınır.

Tek bir LAC göz molekülünün tek bir gerilmiş DNA molekülü üzerinde difüzyonunu ve spesifik bağlanmasını ve LAC göz hareketinin kinetik parametrelerinin nicelleştirilmesini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin mevcut tek moleküllü yöntemlere göre temel avantajları, yeni moleküle uygulanan gerilimi kontrol etme imkanı, bağlayıcı proteinlerin hareketlerini nanometre kararlı bir nokta üzerinde hassas bir şekilde izleme imkanı ve aynı zamanda kapak uyku yüzeyinden uzakta çalışabilme yeteneğidir. Bu yöntem, protein DNA etkileşimleri, özellikle gen ekspresyon düzenlemesinin mekaniği ve hedef arama mekanizmalarında DNA boyunca protein difüzyonunun dinamikleri hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntemin bu gösterimi, akış hücresi numunesinin işlenmesinin ve beat DNA boncuk yapısının montajının pratik yönlerini göstermek için çok yararlıdır. Bu videoda ilk olarak, referans olarak bir örtü kayma yüzeyine yapıştırılmış mikro boncuklar kullanılarak iki yakalama lazerinin işaretleme kararlılığının nasıl kontrol edileceği gösterilecektir. Optik cımbız kurulumunun tasarımı ve yapımı ile ilgili ayrıntılar ekteki protokol metninde bulunabilir.

24 x 32 milimetrelik bir kapak kaymasının yüzeyine iki mikrolitre silika boncuk yaymak için 24 x 60 milimetrelik bir kapak fişi kullanın. İki parça çift taraflı bant kullanarak. Bir akış hücresi oluşturmak için 24 x 32 milimetrelik kapak kızağını bir mikroskop lamına takın.

Akış hücresini 50 milimolar fosfat tamponu ile doldurun ve silikon gres görüntüsü ile kapatın. Yaklaşık 2000 kat büyütmede parlak alan mikroskobunda bir silika boncuk. Görüş alanı, boncuk görüntüsünün yaklaşık 190 piksellik bir çapa sahip olması, görüntü merkezinden XY konumunu hesaplayan bir geri besleme yazılımı ile termal sapmaları telafi etmesi ve kırınım halkalarından Z'yi oluşturması ve sapmaları düzeltmesi için 7 68 x 5 76 pikselde elde edilen yaklaşık yedi x beş mikrometre olmalıdır.

Bir pizo aşamasını nanometre hassasiyetinde veya daha iyi bir şekilde hareket ettirerek, sol tuzağın merkezini boncuk merkeziyle örtüştürün ve konum gürültüsünü ve kadran dedektöründen, foto diyottan veya QDP'den standart sapmasını ölçün. Doğru tuzak için ölçümü tekrarlayın. Akış hücresini oluşturmak için DNA bağlayıcı proteinlerin hassas lokalizasyonuna izin vermek için konum gürültüsünün standart sapması birkaç nanometre içinde olmalıdır.

Bir elmas uç ilk olarak 76 x 76 x bir milimetre mikroskopta bir milimetre çapında delikler açmak için kullanılır. Dört giriş ve bir çıkış oluşturmak için kaydırın. Bu, dört adede kadar paralel arabellek akışına izin verecektir.

Her biri deney boncukları, DNA floresan etiketli protein ve görüntüleme tamponu için gerekli farklı bileşenlerden birini içerir. Mikroskop slaytını etanol ile temizleyin ve O-ring takılıyken portu ve erişim deliklerini çevreleyen sürgüdeki yapışkan halkayı ortalayın. Yapıştırma işlemini bozacak parmak izlerinden kaçınmak için bu adımda eldiven giymek önemlidir.

İkinci bir sürgü yardımıyla, nano portları sürgüye sıkıştırın ve tam bir takma sağlamak için bir saat boyunca 180 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir fırına yerleştirin. Bu arada, akış hücresinin anahat desenini bir kağıda çizin. Kanal yaklaşık üç milimetre genişliğinde olmalı ve mikroskop lamı üzerindeki tüm konumlarla eşleşmelidir.

Çizimi iki parça perfilin üzerine yerleştirin ve bir neşter ile çizilen anahat boyunca keskin ve sürekli kesimler yapın. Oluşan çıkıntıları çıkarın, sadece temiz bir desteği garanti etmek için kullanılan alt parfüm tabakasını atın. Ardından, bağlı nano portları içeren mikroskop slaytını metalik desteğe baş aşağı yerleştirin.

Paraform odası taslağını deliklerle dikkatlice hizalayın, parametrenin hazne kapağının girişlerini ve çıkışını temizlenmiş bir mikroskop kapağı kayması ile dışarı çıkarmadığından emin olun ve hazneyi çevreleyen fazla paramları dikkatlice çıkarın. Daha önce 120 santigrat derecede ısıtılmış iki ısı bloğunu akış hücresinin üzerine homojen bir basınç uygulayacak şekilde yerleştirin. Para filmin yaklaşık 25 dakika erimesine izin verin.

Bir sonraki adım, basınç rezervuarını ve tampon kaplarını hazırlamaktır. Basınç rezervuarı pleksiglastan yapılmıştır ve altı adede kadar tampon kabının yerleştirilmesine izin verir. İlk olarak, valf kolu dikey konumdayken veya saat yönünde döndürülmüş konumda kapalıyken tampon akışını açmak için tampon kaplarının çıkışındaki kapatma vanalarını bağlayın.

Deneyler sırasında, akış hücresini mikroskop aşamasına monte edin. Ardından kapatma vanalarını poli eter, eter keton veya tepe borusu aracılığıyla ve flanşsız eğirmeleri akış odası girişlerine bağlayın. Tepe borusunun iç çapı yaklaşık 150 mikrometre kilometredir, iç çapı yaklaşık 500 mikrometre olan yaklaşık üç santimetre florlu etilen propilen boru, tepe borusu ile akış hücresinin nano port düzenekleri arasında bir bağlantı olarak kullanılır.

Bu, akış hücresinin kırılmasını veya nano portun camdan ayrılmasını önlemek için hazne girişindeki tampon akışını azaltmak için gereklidir. Öte yandan, tek başına büyük iç çaplı boruların kullanılması, büyük hacimlerde biyolojik numune gerektirecektir. Akış odası çıkışını atmosferik basınçta açık bir Falcon tüpüne bağlayın.

Bu tüp, akış odasından dışarı akan tampon için bertaraf görevi görür. Bu prosedüre başlamak için, tampon kaplarının her birine bir mililitre tampon A ekleyin ve bağlantı tüplerini ve akış hücresini yıkamak için 200 milibar basınç uygulayın. Bir basınç kontrol sistemi yeteneklidir.

Son olarak, basınç rezervuarı içindeki hava basıncının ayarlanması. Akış düzgünlüğünü bozabilecek hava kabarcıklarının varlığını kontrol edin. Çıkış borusuna hafif bir fiske vurmak, kalan kabarcıkların giderilmesine, basıncın 20 milibara düşürülmesine ve tüm kanalların ve tüplerin hava kabarcıklarından arındırıldığını ve tamponun tüm kanallarda benzer hızlarda aktığını doğrulamaya yardımcı olacaktır.

Numuneleri 300 mikrolitrelik son hacme hazırlayın. Bu deney, strept kaplı polistiren boncuklar, laktoz baskılayıcı bağlanması için spesifik hedef diziler ve floresan etiketli laktoz baskılayıcı protein içeren her iki ekstremitede biyotinile edilmiş doğrusal DNA kullanır. Her bir numuneyi şırınga kaplarından birine aşağıdaki sırayla ekleyin: birinci kanaldaki boncuklar, ikincideki DNA, üçüncüdeki görüntüleme tamponu ve dördüncü kanaldaki etiketli protein.

Akışı 20 milibarda açın ve numunelerin akış kanalının içine ulaşmasını sağlamak için kapatma vanalarını açın. Bu, boncuk kanalında kolayca tespit edilebilir. Parlak alan aydınlatması altında ilk kanalı görüntülerken, iki optik cımbızı açın ve her tuzakta bir polistiren boncuk yakalayın.

Diğer boncukların tuzaklara düşmesini önlemek için hızla ikinci kanala geçin. DNA kanalına varışın, boncuk akışının sonunda kolayca fark edildiğine dikkat edin. Bir AO optik deflektör veya bir OD hareketi kullanarak, iki optik olarak hapsolmuş boncuk arasına akış uzatılmış DNA'nın bağlanmasına izin vermek için bir tuzak boncuğu diğer boncuğun yakınında ileri geri hareket ettirin.

Bir DNA dambıl oluştuğunda, statik boncuk, tuzak tarafından aktif olarak ileri geri hareket ettirilen boncuğun hareketini takip etmeye başlar. Hızlı bir şekilde tampon kanalına gidin ve tampon akışını kapatın. Tek bir DNA molekülünün varlığını doğrulamak için bir kuvvet uzatma eğrisi analizi yapın.

Bu, DNA gerilimini ölçerken iki boncuğu birbirinden ayırarak gerçekleştirilir. Tek bir DNA dambıl elde edildikten sonra, akışı tekrar açın ve dambılı protein kanalına hareket ettirin. Etiketli laktoz baskılayıcı proteinin DNA ile etkileşimini izlemek için geniş alan floresan mikroskobuna geçin, akışı kapatın ve edinimi başlatın.

Bu yöntem, gerilmiş bir DNA molekülü ile etkileşime giren tek laktoz baskılayıcı veya lak göz moleküllerinin tespit edilmesini sağlar. Bu temsili CH agramında, tek bir lak göz molekülü, spesifik olmayan DNA dizileri boyunca yayılırken, başka bir lak göz molekülü, DNA molekülünün merkezinde bulunan bir operatöre spesifik olarak bağlanır. Bu grafik, iki tuzağın merkezlerini birbirine bağlayan yön boyunca iki lak göz molekülünün konumunu göstermektedir.

Zamanın bir fonksiyonu olarak, moleküllerin konumları radyal simetri merkezi algoritması ile belirlendi, burada gösterilen, gerilmiş bir DNA molekülü boyunca yayılan tek bir lak göz molekülü için ortalama kare yer değiştirmenin veya MSD'nin zamana karşı bir grafiğidir. Proteinin difüzyon katsayısı, verilerin doğrusal regresyonundan kolayca elde edilebilir. Manipülasyon ve görüntüleme tekniklerinin kombinasyonu, D-N-A-R-N-A veya bir hücre iskeleti filamenti gibi tek bir biyolojik polimer üzerinde mekanik kontrole ve polimerin kendisiyle etkileşime giren tek protein moleküllerinin eşzamanlı lokalizasyonuna izin veren güçlü bir yöntemdir.

Bu Prosedürü denerken, tek molekül manipülasyonu ve görüntüleme tekniklerinin birleştirilmesinin, asılı polimerin nanometre düzeyinde stabilitesini sağlamak için deney düzeneğinin dikkatli bir şekilde tasarlanmasını gerektirdiğini hatırlamak önemlidir. Öte yandan, yakalama G lazeri ile floresan prob arasında özel bir ayrımı garanti etmek için biyolojik probun uygun şekilde tasarlanması gerekir. Ayrıntılar için lütfen ekteki protokol metnine bakın.

Bu videoyu izledikten sonra, bu yapının montajını iki optik hızlı vuruş arasında DNA molekülünün nasıl bir araya getirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Ayrıntılı açıklamasını sağladığımız çok kanallı akış hücresi ile daha iyi elde edilir. Ayrıca, tampon akışının nasıl optimize edileceğini ve aksi takdirde deneylerinizi tehlikeye atabilecek hava kabarcıklarının nasıl giderileceğini de belirttik.

Birleştirme metin protokolünde, streptavidin kaplı atımlarla montaj için gerekli olan DNA'yı bioTE ile etiketlemek için protokolleri ve proteini etiketlemek için protokolleri bulabilirsiniz. Son olarak, tek bir laktoz baskılayıcı proteinin gergin bir DNA molekülü üzerindeki bağlanmasını ve difüzyonunu ölçmek için adım adım işlemleri gösterdik.