Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma E. coli

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, otomatik bir sıvı işleme robotu kullanarak e coli'de çözünür proteinlerin seviyesini ölçmek için yüksek verimli bir ifade tarama protokolü kullanmaktır. Bu, ilk aşılama ile gerçekleştirilir.96. Ertesi gün hedef füzyon proteinlerini kodlayan plazmitlerle dönüştürülmüş hücrelere sahip kuyu ön kültürleri, otomatik indüksiyon ortamı ile doldurulmuş 24 oyuklu plaka, ekspresyon oluşturmak için gece boyunca ön kültürlerle aşılanır.

Hasattan sonra kültürler ve ekspresyon kültürlerinden çözünebilir proteinler dondurulduktan sonra immobilize metal afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Sonuç olarak, protein üretimi ve başarılı hedeflerin oluşturulması için en uygun ekspresyon koşullarını belirlemek için her bir bozulmamış hedef füzyon için çözünürlük seviyeleri ölçülebilir. Bu tekniğin geleneksel artan verimlilik yöntemlerinin avantajlarından, partiden partiye radyasyonun sınırlı olması ve veri işleme ve izlemenin basitliği Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

Otomatikleştirilmiş adımlar, metnin prosedürün hızını veya basitliğini iletmediği için göz korkutucu ve tek başına metin biçiminde anlaşılması zor görünebilir. Bakterilerin dönüşümünden sonra, ilk 24 kuyulu LB agar plakasının kapağını bir kenara koymak için robotik tutucuyu kullanarak başlayın. Daha sonra, 96 kuyulu bir dönüşüm plakasından 50 mikrolitre dönüşüm karışımını karıştırmak ve ardından aspire etmek için sekiz kanallı sıvı işleme kolunu kullanın.

Sıvı işleme kolunun ilk dört kanalındaki dönüşüm karışımını LB agar plakasının ilk sütununa ve son dört kanaldaki dönüşümleri LB agar plakasının ikinci sütununa dağıtın. Dağıtımdan sonra tüm uçları iyice yıkayın ve ardından dönüşüm karışımını 96 oyuklu plakadan LB agar plakasının sonraki dört sütunundaki tüm kuyucuklara aktarmaya devam edin. O tabak bitti. İlk plakaya aktarım tamamlandıktan sonra, kapağı değiştirin ve bir sonraki plaka için aktarıma başlayın. Tüm dönüşümler kaplandıktan sonra, dönüşüm karışımının homojen bir dağılımını oluşturmak için tüm plakaları 1200 RPM'de bir dakika çalkalayın.

Daha sonra karıştırdıktan sonra, 96 oyuklu plakadan kalan dönüşüm karışımının 60 mikrolitresini aspire etmek için 96 çok kanallı kolu kullanın ve karışımı LB suyu içeren derin bir kuyu 96 plakasına dağıtın. Kültür havalandırmasının havalandırılmasına izin vermek için derin kuyu 96 ön kültürü nefes alabilen yapışkan filmle kapatın ve ardından plakayı gece boyunca maksimum hızda 37 santigrat derece çalkalama inkübatörüne yerleştirin. Ön kültürler inkübatöre girdikten sonra, LB agar plakalarını kapakları kapalı olarak yaklaşık 10 dakika boyunca bir başlık içinde sürün.

Daha sonra plakaları gece boyunca 37 santigrat derecelik bir plaka inkübatörde ters çevirin. Ertesi gün, gece boyunca 100 mikrolitre ön kültürü derin bir kuyu 96 plakasına aspire etmek için sıvı işleme kolunu kullanın ve ekspresyon kültürlerini daha önce olduğu gibi aynı şemayı kullanarak, sıvı işleme kolunu yıkama istasyonunda iyice yıkayın. Aşılama bittiğinde, ekspresyon kültürlerini dört saat boyunca nefes alabilen yapıştırıcı ile kapatılmış 37 derece Santigrat derece çalkalama inkübatöre yerleştirin.

Ardından, gece boyunca inkübasyon için sıcaklığı 17 santigrat dereceye düşürün. Ertesi sabah, derin kuyu 24 plakasını 3000 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı bir antimikrobiyal ajan içeren bir atık kabına atın ve ardından kültürlerin doğru şekilde büyüdüğünü doğrulamak için herhangi bir kalıntı ortamı çıkarmak için plakaları emici kağıda baş aşağı vurun. Derin kuyuda pelet olup olmadığını kontrol edin.

Daha sonra 125 mikrolitre lizis tamponunu aspire edin ve tamponu derin kuyunun her bir kuyucuğuna iki kez, her bir oyuğa dört uçlu 24 plaka dağıtın. Peletleri yeniden süspanse etmek için bir mililitre lizis tamponunun son hacmine ulaşmak için, plakaları beş dakika boyunca 1200 RPM'de çalkalayın. Robotta, hücre süspansiyonlarını derin bir kuyu 96 plakasının uygun kuyularına geri aktarın ve plakaları en az bir saat boyunca eksi 80 santigrat derecede kapalı olarak saklayın.

Bu gösteri için, hedef füzyon proteinlerinin saflaştırılması için 50 mikrolitre nikel boncuklu protokolü kullanacağız. İlk olarak, derin kuyu 96 plakasını bir su banyosunda yaklaşık 15 dakika çözdürün. Daha sonra resus, hücre lizatlarını çalkalama inkübatöründe maksimum hızda 10 dakika daha askıya alır, kültürler viskoz hale gelmelidir.

Daha sonra, DNA'ları ve magnezyum sülfatı dağıtmak için manuel sekiz kanallı bir pipet kullanın Derin kuyu 96 plakasının her bir oyuğuna, sırasıyla mililitre ve 20 milimolar başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar karıştırın. Plakayı 15 dakika daha kapalı olarak çalkalayın, bu sırada kültür viskoz olmamalıdır. Saflaştırma sırasında filtre plakasının tıkanmasını önlemek için, lizatların hiçbirinin artık viskoz olmadığını dikkatlice görsel olarak kontrol etmek çok önemlidir.

Sıvı taşıma robotunda, 200 mikrolitre bulamacın lizat içeren derin kuyu 96 plakasına aktarılmadan önce reçine bulamacını iyice karıştırmak için 200 mikrolitre geniş delikli uçlar kullanın. Bağlanmayı sağlamak için derin kuyu 96 plakasını 1400 RPM'de ve oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayın ve ardından 1200 mikrolitre reçine lizat bulamacının tamamını 200 mikrolitrelik alikotlarda karıştırmak için geniş delikli uçları kullanın ve ardından filtre plakasına aktarın. Şimdi, lizatı plakadan süzmek ve akışı derin bir kuyuda toplamak için vakumu yaklaşık 30 saniye açın.

Derin kuyunun altında 96 akış içeren 96 filtre plakasının altından çıkarılır ve deneyin sonuna kadar bir rafta saklanır. Daha sonra reçineyi ikinci yıkamadan sonra her seferinde 800 mikrolitre bağlayıcı tampon ile iki kez yıkayın, 50 milimolar I midaz yıkamasını toplamak için filtre plakasının altına taze, derin, kuyulu 96 bir plaka yerleştirmek için robotik tutucuyu kullanın. Filtre plakasına 150 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve tampon 96 içeren derin kuyudan geçene kadar vakumu tekrar uygulayın.

Yıkama, filtre plakasının altından çıkarılır ve deneyin sonuna kadar bir rafta saklanır. Daha sonra, bağlayıcı tampon yıkamaları için gösterildiği gibi 800 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez daha yıkadıktan sonra, mikroplakayı çalışma masasına aktarmak için robotik tutucuyu kullandı ve elucian'ı toplamak için SPE bloğunu ve filtre plakasını mikroplakanın üzerine geri koydu. Daha sonra filtre plakasındaki reçineye 190 mikrolitre Elucian tamponu ekleyin.

Üç dakika sonra, tüm tamponun geçmesine izin vermek için vakumu bir dakika uygulayın. Hızlıca, Ellucian ciltlerinin doğru olup olmadığını görsel olarak kontrol edin. Son olarak, çözünür ekspresyon seviyesinin ölçülmesi için Ellucian yıkama ve akış numunelerinin plakalarından geçmesini engelleyin.

Önce ellucian plakasını analiz edin ve sadece gerektiğinde, ilgili yıkamayı ve fraksiyonlardan akışı kontrol edin. Bu veriler, kaliper laboratuvar çip sisteminden elde edilen bir elektroforez sonucunu göstermektedir. Sağlam bölünmüş füzyon proteinleri, üst bantlar tarafından temsil edilir ve bölünmüş protein fragmanları alt bantlar olarak temsil edilir.

Her bir hedef protein için füzyon verimlerinin, litre kültür seviyeleri başına 0.1 ila iki, iki ila 10 ve 10 ila 25 mikrogram aralığında olduğu belirlendi veya bazı durumlarda tespit edilmedi. Protein ekspresyonunun başarısının, her bir füzyon proteini fragmanı içinde bulunan diss sülfür bağlarının sayısı ile değerlendirilmesi, test edilen tüm disülfür bağlarının sayısı için makul bir başarı gösterir ve en düşük başarı seviyesi, altı disülfid bağı içeren hedefler için %66'dır. İzoelektrik noktaya ve kalıntı sayısına dayalı olarak ifade başarısının dağılımının analizi, hem başarılı bir şekilde ifade edilen hedefler hem de çizim boyunca dağılmış olarak tespit edilmeyen hedefler ile teknik için özel bir yanlılık göstermez.

Füzyonlar tespit edildikten ve parçalandıktan sonra, saflaştırılmış hedefler elektrosprey iyonizasyonu, kütle spektrometresi ile kalite kontrolüne tabi tutulur. Burada gösterilen temsili hedef, dört disülfid bağına sahip 5.7 kilodalton dis sülfür açısından zengin bir zehir proteinidir. Bu spektrum, daha fazla müdahale olmaksızın bölünme ve tuzdan arındırma işleminden sonra olduğu gibi, DTT ile indirgemeden önce proteinin sonuçlarını gösterir.

Bu spektrum, DTT ile indirgendikten sonra proteini ve ardından fazla DTT'yi çıkarmak için tuzdan arındırmayı gösterir. Oklar, deney kütlelerine karşılık gelen iyonları gösterir ve her iyonun tanımı yeşil renkle gösterilir. Bu iyonlar için hesaplanan deneysel ana kütleler tabloda gösterilmiştir ve dört oksitlenmiş kalıp sülfür bağına eşdeğer sekiz Daltonluk bir kütle farkına karşılık gelir.

Kurulduğunda, tam protokol bir hafta içinde binden fazla kültürde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek verimli yöntemler kullanarak çözünür protein üretimi için gerekli başarılı koşulları belirlemek için küçük ölçekli e coli kültürlerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.