Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, EMT sırasında alternatif eklemedeki değişiklikleri tespit etmektir. Bu, füzyon proteininin ekspresyonunun büküldüğü indüklenebilir bir EMT modeli kullanılarak elde edilir. İnsan memelisinde epitel hücreleri, ikinci adım olarak tamoksifen tedavisi üzerine hücrelerin EMT'ye tabi tutulmasını tetikler.

Ek izoformlarının ekspresyonu, RNA seviyesinde alternatif ekleme değişikliklerini ortaya çıkaran izoforma özgü primer setleri kullanılarak kantitatif R-T-P-C-R ile analiz edilir. Daha sonra, her bir izoforma karşılık gelen protein bolluğu, protein seviyesinde ek izoformlarının ekspresyonunu doğrulamak için immünoblotlama ile belirlenir, kantitatif R-T-P-C-R ve immünoblotlama analizlerine dayalı olarak, EMT sırasında ilgilenilen genlerde alternatif eklemedeki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilir, Bu yöntem, RN alternatif birleştirme ve EMT alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, EMT sırasında alternatif eklemenin nasıl düzenlendiği ve bu düzenlemenin EMT ve EMT ile ilgili patolojik süreçleri nasıl etkilediği gibi. Bu tekniğin etkileri kanser tedavisine yöneliktir, çünkü EMT tümör invazyonunu ve metastazı teşvik etmede önemli bir rol oynar.

Bu yöntem, EMT sırasında alternatif birleştirme hakkında bilgi sağlayabilir. İzoforma özgü MRA tespiti yöntemi, nöron farklılaşmasında alternatif uçbirleştirmenin incelenmesi ve hücre ölümlerinin programlanması gibi diğer sistemlerde de uygulanabilir. İlk adım, büküm ER füzyon proteinini eksprese eden hücreleri plakalamak, hücreleri iki kopya halinde 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına tohumlamak, daha sonra, epitelyal mezenkimal geçişi indüklemek için Tamoksifen çözeltisini hazırlamak ve ışıkla korumak, veya tamoksifen ile tedavi edilmemiş bir kontrol grubu için 20 nanomolar tamoksifen içeren ortam ile EMT tedavi hücreleri, inkübasyondan iki gün sonra ek bir hücre grubuna% 0.01 etanol ekleyin.

Herhangi bir morfolojik değişikliği kaydetmek için 10 x büyütmede ışık mikroskobu altında fotoğraf çekin. Ardından, hücreleri soğuk PBS ile yıkayın. Hücreleri plakanın bir yarısından RNA izolasyonu için RNA lizis tamponuna ve diğer yarısını protein analizi için 100 mikrolitre buz gibi soğuk ripa tamponuna kazıyın, hücreleri daha önce gösterildiği gibi her iki gruptan geçirin ve sürekli olarak 20 nanomolar tamoksifen veya araç ile tedavi edin.

Bu adımları 14. güne kadar her gün tekrarlayın, bu sırada Tamoksifen ile tedavi edilen büküm ER hücreleri iğ şeklinde bir mezenkimal morfoloji göstermelidir. Oysa araçla tedavi edilen kontroller, parke taşını epitel morfolojisi gibi korumalıdır. Burada, ekzon inklüzyonu tespit etmek için bir örnek olarak dört ekzon prem NNA kullanılmıştır.

Değişken ekzon üç'ün içinde bir ileri astar ve yakındaki kurucu ekzon dört'ün içinde bir ters astar tasarlayın. Ekzon atlama olaylarını spesifik olarak amplifiye etmek için ekzon dahil edilen izoform değişkeninin spesifik amplifikasyonuna izin vermek. Kurucu ekzon iki ve ekzon dördün birleşimini kapsayan, aksi takdirde değişken ekzon üç dahil edildiğinde yok olacak olan primerler tasarlayın.

Genin toplam transkriptlerini tespit etmek için kurucu ekzon dördünün içindeki diğer primeri tasarlayın ve hazır olduğunda genomik DNA'dan veya prem NA.Design primerlerinden amplifiye edilmiş PCR ürünlerinden kaçının. Daha önce toplanan hücre örneklerinden RNA'yı izole etmek için standart RNA ekstraksiyon prosedürlerini takip eder. İlk iplikli CD NA'yı sentezlemek için UV absorpsiyonu ile RNA'nın konsantrasyonunu ve kalitesini belirleyin, 20 mikrolitrelik bir son hacimde ters transkriptaz reaksiyonları oluşturun.

Bir saat boyunca 42 santigrat derecede RT reaksiyonları gerçekleştirin, ardından beş dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübasyon yapın. RT enzimini gerçek zamanlı olarak etkisiz hale getirmek için. PCR, 10 mikrolitre siber yeşil ana karışım, 0.1 ila 1.0 mikrolitre CD, NA şablonu ve beş pikomol, ileri ve geri primerden oluşan 20 mikrolitre reaksiyon kurdu.

Üç kopya halinde 40 döngü ile gerçek zamanlı PCR çalıştırın. Ayrışma eğrilerini kontrol edin ve her astar seti için tek bir tepe noktasının gözlendiğinden emin olun. Amplifikasyon eğrilerinin ikinci türev değerlerini hesaplayarak niceleme döngüsü değerlerini elde edin.

Bu formülde gösterildiği gibi delta delta CQ yöntemini kullanarak indüklenmemiş numuneye kıyasla indüklenmiş numunelerdeki hedef mRNA'ların nispi miktarını hesaplayın. Protein analizi için toplanan hücreleri, süpernatanı santrifüjlemeden ve toplamadan önce yaklaşık 10 dakika buz üzerinde bırakın. Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, numuneleri SDS yüklemesinde seyreltin, tamponlayın ve 20 ila 40 mikrogram proteini %10 SDS sayfa jellerine yükleyin.

SDS sayfa jellerini 1,5 saat boyunca 20 miliamperde çalıştırın. Bu süreden sonra, proteinleri 85 voltta üç saat boyunca dört santigrat derecede ıslak bir transfer sisteminde PVDF membranlarına aktarın. Transfer süresini hedef proteinlerin moleküler ağırlığına göre ayarlayın.

Daha sonra, zarı %5 yağsız sütte 30 dakika ila bir saat arasında bloke edin. Oda sıcaklığında, zarı gece boyunca dört santigrat derecede bir birincil antikor ile inkübe edin. Birincil antikor, yapısal ekzon kaplama bölgesindeki epitopu tanır ve farklı protein boyutlarına göre slic izoformlarını aynı anda tespit eder.

Aynı zamanda, EMT'yi immüno-blotting ile izleyin. EMT işaretçileri için. Epitel belirteçleri olarak eec, ahern, gama katenin ve okkludin ve mezenkimal belirteçler olarak fibronektin n kaderin ve menton kullanın.

Ertesi gün, zarı beş dakikalık aralıklarla TBST ile üç kez yıkayın. Daha sonra, zarı oda sıcaklığında bir saat boyunca bir ila 10.000 seyreltmede bir HRP konjuge ikincil antikor ile inkübe edin. Bu sürenin sonunda, zarı beş dakikalık aralıklarla TBST ile üç kez yıkayın.

Son olarak, proteinleri bir kemilüminesans tespit sistemi ile görselleştirin ve zarı bir oto radyografi filmine maruz bırakın. Bükümün neden olduğu EMT, parke taşı benzeri bir epitel fenotipinden uzun bir fibroblastik fenotipe geçiş ile karakterize edildi, bu da epitel belirteçleri, e kaderin, gama katenin ve oklüdinin yokluğunu ve mezenkimal belirteçlerin, fibronektin n kaderin ve vimentinin yukarı regülasyonunu gösterdi. Ayrıca, EMT, gösterilen hücre hücre bağlantılarında EC kaderin lokalizasyonunun kaybı ile değerlendirildi.

İşte CD 44 ek izoformlarının tespiti için astar tasarımları. Astar konumları farklı renkli oklarla gösterilir. Q-R-T-P-C-R analizlerinden elde edilen sonuçlar, 14 günlük TAM tedavisinden sonra CD 44 V mRNA'da önemli bir azalma ve CD 44 s mRNA'da artış olduğunu göstermektedir.

Buna karşılık, CD 44'ün toplam transkripti, Q-R-T-P-C-R sonuçlarıyla tutarlı olarak EMT sırasında değişmeden kaldı, CD 44 V'nin protein seviyesi önemli ölçüde azalırken, CD 44 s proteininin ekspresyonu büyük ölçüde yukarı regüle edildi. KBB'nin başarılı bir şekilde indüksiyonunun çok önemli olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, KBB belirteçlerinin hücre morfolojisi ekspresyonundaki değişikliklerin tespiti ve RIN'in hücre yüzeyinde lokalizasyonu gibi çeşitli yöntemlerle KBB dikkatli bir şekilde doğrulanmalıdır.

Bu Prosedürü takiben, bu etkili elementler ve işlem yapan faktörler, geliştirildikten sonra alternatif ekleme düzenlemesini nasıl etkiler gibi ek soruları yanıtlamak için birleştirme raportörü yönetim testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, RNA biyolojisi, gelişim biyolojisi ve kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların, normal gelişim ve kanser metastazı sırasında EMT süreçlerinde alternatif ekleme düzenlemesini keşfetmelerinin yolunu açtı.