RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması
24 Haziran 2021
Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.
Bu protokol, diferansiyel ekleme bölgelerini, diferansiyel olarak eksprese edilen ekzonları ve poli (A) bölgelerini tanımlamak için adım adım bir iş akışı sağlayarak alternatif ekleme ve poliadenilasyon tarafından üretilen gen izoformlarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bu protokolün temel avantajı, alternatif eklemeyi incelemek için hem ekzon tabanlı hem de olay tabanlı yöntemleri değerlendirmesidir. Ayrıca alternatif poliadenilasyonu incelemek için ekzon bazlı yöntem uygular.
AS ve AP analizi için kodları ve notları içeren R Markdown dosyaları sağlanmıştır. R Markdown dosyasındaki adımları izlemeniz ve her adım için nota dikkatlice ulaşmanız önerilir. Limma'dan diffSplice kullanarak diferansiyel eklemeyi tanımlamak için R not defteri dosyasını izleyin.
Giriş dosyalarını metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın. Daha fazla ilerlemeden önce giriş dosyalarını hazırlamak için makaledeki bir ila üç arasındaki adımların sırayla takip edildiğinden emin olun. Gerekli kütüphaneleri yükleyerek başlayın.
Spesifik olmayan filtreleme gerçekleştirmek için, önce daha önce elde edilen okuma sayılarının matrisini ayıklayın ve satırların genleri ve sütunların örnekleri temsil ettiği edgeR paketinden DGEList işlevini kullanarak özelliklerin bir listesini oluşturun. Ardından, edgeR paketindeki BGBM işlevini kullanarak verileri ham ölçekten milyon başına sayıma dönüştürün ve ayarlanabilir bir eşiğin üzerinde sayımlara sahip ekzonları saklayın. Bu veri kümesi altı örnek içerir.
Bu nedenle, BGBM birden büyük ve altıdan en az üç örnek olarak ayarlanır. M değerlerinin Kırpılmış Ortalama değerini kullanarak edgeR paketinden calcNormFactors işleviyle numuneler arasındaki sayımları normalleştirin. Bu işlev, kitaplık boyutlarını ayarlamak için ölçeklendirme faktörlerini hesaplar.
Her numunenin deneysel koşullarını tanımlamak üzere tasarım matrisini oluşturmak için önceden oluşturulmuş örnek tabloyu kullanın. Varyansı tahmin etmek üzere RNA dizileme verilerini işlemek için limma paketinin voom işlevini çalıştırın. Bu işlev, Poisson sayım gürültüsünü düzeltmek için hassas ağırlıklar üretecek ve ekzon seviyesi sayımlarını milyonda iki sayım veya logCPM günlüğe kaydedecek şekilde dönüştürecektir.
Doğrusal modelleri her ekzonun ifade verilerine sığdırmak için lmfit işlevini çalıştırın. Ardından, diferansiyel ekzon ifadesini algılamak üzere takılan modelin ampirik tabanlı istatistiklerini hesaplamak için eBayes işlevini çalıştırın. İlgilenilen deneysel karşılaştırmalar için bir kontrast matrisi tanımlayın.
Kontrastları kullanın. Her bir karşılaştırma çifti için katsayılar ve standart hatalar elde etmek için fit işlevi. Vahşi tip ve nakavt arasındaki genlerin ekzon kullanımındaki farklılıkları test etmek için takılı modelde diffSplice çalıştırın.
T'ye eşit bir testin AS ekzonların sıralamasını verdiği ve simelere eşit testin genlerin bir sıralamasını verdiği topSplice işlevini kullanarak en üst sıradaki sonuçları keşfedin. Sonuçları çizmek için plotSplice işlevini çalıştırın. İlgilenilen geni gen kimliği argümanına koyarken, kırmızı noktalar farklı şekilde ifade edilen ekzonları gösterir.
Farklı şekilde ifade edilen ekzonları sergilemek için EnhancedVolcano biyoiletken paketini kullanarak bir volkan grafiği oluşturun. rMATS'ı kullanmak için, rMATS sürüm 4.1.1'in en son sürümünün çalışma dizininde conda veya GitHub kullanılarak yüklendiğinden emin olun. Eşlemeden sonra elde edilen bam dosyalarını içeren klasöre gidin.
Metin dosyalarını, bam dosyalarının adını ve virgülle ayrılmış yollarını kopyalamanın iki koşulu için rMATS'ın gerektirdiği şekilde hazırlayın. Ramas çalıştırın. py, bam dosyalarının yolunu ve ek açıklamayı açıklayan iki oluşturulan giriş metni dosyasını kullanarak.
gtf dosyası daha önce elde edilmiştir. Bu, rmats_out her ekleme olayı için ayrı ayrı P değerleri ve ekleme düzeyleri dahil olmak üzere istatistikleri açıklayan metin dosyalarını içeren bir çıktı klasörü oluşturur. rMATS sonuçlarını keşfetmek için biyoiletken paket maserini kullanın.
Kavşak ve ekzon sayma metin dosyalarını JCEC uzantısıyla maser nesnesine yükleyin ve sonucu kapsama alanına göre filtrelemek için ekleme olayı başına en az beş ortalama okuma ekleyin. rMATS sonuçlarını görselleştirmek için, önce maser paketinden topEvents işlevini çalıştırın, önemli ekleme olaylarını %10'luk yanlış bulma oranında ve PSI veya PSI içine eklenmiş yüzde olarak en az %10'luk bir değişiklikle seçin. İlgilenilen bireysel genler için gen olaylarını kontrol edin ve bu genin her bir ekleme olayı için PSI değerlerini çizin.
Olay türünü belirterek bir volkan grafiği oluşturun. rmats2sashimiplot paketini kullanarak sashimi grafikleri oluşturmak için rMATS ile elde edilen ekleme olayları sonuçlarını metin dosyaları biçiminde kullanın. Sashimi komplosu, Wnk1 geninde atlanan bir ekzon olayını göstermektedir.
Her satır bir RNA-seq örneğini, vahşi tipte üç kopyayı ve Mbnl1 nakavtını temsil eder. Yükseklik, RPKM cinsinden okuma kapsamını gösterir ve bağlantı yayları, ekzonlar boyunca kavşak okumalarını gösterir. Alt kısımda açıklamalı gen modeli alternatif izoformları gösterilmektedir.
DiffSplice ve DEXSeq kullanılarak elde edilen volkan arazilerinin sol üst veya sağ kadranlarında bulunan genlerde önemli bir kıvrım değişimi ve gerçek farklılıkların güçlü istatistiksel kanıtları gözlemlenebilir. Bir kaset ekzonunun, Wnk1 geni için farklı koşullar arasında değiştiği bulundu. Diferansiyel ekzon kullanım grafiği, Wnk1.6.45 yakınlarındaki beş ekzon bölgesinde diferansiyel ekleme kanıtı gösterdi ve pembe renkle vurgulanan ekzonların vahşi tipe kıyasla Mbnl1 nakavt örneklerinde eklenmesi muhtemeldi.
Alternatif olarak eklenen genlerin volkan grafiği, vahşi tipten dışlanan genler ile vahşi tipe dahil edilenler arasında ayrım yapılmasına yardımcı oldu. SE, A5SS, A3SS, MXE ve RI ekleme olaylarının türleri, bu olayların en önemli genlerinin sashimi grafikleri kullanılarak görselleştirildi. Genlerin üç ana çevrilmemiş bölgesindeki diferansiyel APA aktivitesi, volkan grafikleri kullanılarak gözlendi.
Farklı işlem hatlarından elde edilen önemli ölçüde diferansiyel PA sahası kullanım sonuçları, olay grafiği kullanılarak görselleştirildi. Çift nakavtlarda PA bölgesi kullanımının önemli bir distal ila proksimal kayması hem FOSL1 hem de Papola genlerinde gözlenebilir. Genom çapında bilinen PA bölünme bölgelerine demirlenmiş yan bölgelerdeki ortalama kapsama alanı, tanısal bir grafik kullanılarak belirlendi.
Transspesifik bilgiler ve çoklu örtüşmeye izin verme gibi parametrelerin sayım metrikleri oluşturulurken doğru kullanıldığından emin olun. Doğrusal modelin takılması ve kontrast çiftlerinin oluşturulması, doğru karşılaştırma için önemlidir. rMATS için, komutu çalıştırmadan önce tüm parametrelerin verilerinize göre doğru ayarlandığından emin olun.
Diferansiyel ekleme aktivitesinden elde edilen genler, gen seti zenginleştirme analizi yapmak için kullanılabilir. MISO adı verilen başka bir araç, daha fazla olay tabanlı analiz için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, gen ekspresyonu düzenlemesindeki alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyonun (APA) karmaşıklığını ele almaktadır. RNA dizileme verilerini analiz etmek için biyoinformatik protokoller kullanan araştırma, farklı deneysel koşullar altında alternatif ekleme ve poliadenilasyonu tespit etmek ve görselleştirmek için hem ekzon tabanlı hem de olay tabanlı yöntemlerin avantajlarını vurgulamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Alternatif ekleme
- Alternatif poliadenilasyon
- Biyoenformatik
Arka Plan
- Transkript izoform çeşitliliğindeki artış
- Gen ekspresyonu üzerindeki etki
- RNA dizilemedeki teknolojik gelişmeler
Kullanılan Yöntemler
- RNA-seq analizi için biyoinformatik protokoller
- Ekzon tabanlı ve olay tabanlı tespit yöntemleri
- Eklem yerlerinin ve poliadenilasyon olaylarının görselleştirilmesi
Temel Sonuçlar
- Diferansiyel ekleme bölgelerinin ve poli(A) bölgesi kullanımının belirlenmesi
- Çeşitli deneysel koşullarda alternatif ekleme ve poliadenilasyon kanıtları
- Grafikler ve biyoinformatik çıktılar aracılığıyla sonuçların başarılı bir şekilde görselleştirilmesi
Sonuçlar
- Bulgular, farklı koşullar altında AS ve APA'da önemli değişkenlikler olduğunu göstermektedir.
- Bu çalışma, transkript çeşitliliğinin anlaşılmasına ve bunun biyoloji araştırmaları için doğurduğu sonuçlara katkı sağlamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Alternatif ekleme ve poliadenilasyon analizi, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin gen ekspresyonu düzeyinde belirsiz kalan izoform spesifik düzenleyici mekanizmaları çözüme kavuşturmasını sağlar. Bu mekanistik risk azaltma işlemi, genetik pertürbasyonların fonksiyonel sonuçlarını netleştirerek ve öncü bileşik tanımlamadaki öngörü güvenilirliğini artırarak hedef doğrulamasını destekler. Ekzon ve olay tabanlı RNA-seq iş akışlarının entegrasyonu, alt aşama tarama ve translasyonel biyobelirteç geliştirme için assay hazırlığını iyileştirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İzoforma özgü gen düzenlemesini yansıtan diferansiyel ekzon kullanımını ve poliadenilasyon bölgesi kaymalarını tanımlayarak terapötik hipotezleri sorgulayın.
- Operasyonel Değer: Alternatif poliadenilasyonu incelemek için ekzon tabanlı yöntemleri uygulayarak, tek bir RNA-seq veri setinden ekleme (splicing) ve 3' uç işlemenin birleşik analizini gerçekleştirin.
- Öngörücü Değer: Fonksiyonel hedef risk azaltma ve portföy önceliklendirme süreçlerine bilgi sağlayan kaset ekzon varyasyonlarını ve distalden proksimale doğru olan poliadenilasyon kaymalarını tespit edin.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yüksek çözünürlüklü bileşik taramasına uygun, kantitatif ekzon düzeyinde ve ekleme-çıkarma (splicing) olayı çıktıları (örneğin, yüzde eklenen, inklüzyon seviyeleri) oluşturun.
- Operasyonel Değer: Tekrarlar ve koşullar arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için edgeR ve limma iş akışlarını kullanarak sayım verilerini normalize edin ve filtreleyin.
- Analiz Hazırlığı: Eklemleme ve poliadenilasyon dinamiklerinin fonksiyonlar arası incelemesi için volkan grafikleri, sashimi grafikleri ve olay grafikleri gibi görselleştirmeye hazır çıktılar üretin.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Diferansiyel ekleme ve poliadenilasyon olaylarını, nakavt modellerinde gözlemlenen hastalıkla ilgili genlerle (örneğin, Wnk1, FOSL1) ilişkilendirerek mekanistik sürekliliği desteklemek.
- Operasyonel Değer: Yanıltıcı keşif oranı ve eklenmiş yüzde değişimiyle anlamlı ekleme olaylarını filtrelemek için rMATS ve maser paketlerini kullanarak güçlü biyobelirteç adayı seçimine olanak tanımak.
- Translasyonel Değer: Hedef etkileşiminin ve etki mekanizmasının preklinik validasyonunu desteklemek için sashimi grafikleri aracılığıyla izoform spesifik ekspresyon değişikliklerini görselleştirmek.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu iş akışı, hedef doğrulama, assay geliştirme ve öncü bileşik optimizasyonundaki mekanistik takiplere temel oluşturan izoform çözünürlüğünde veriler sağlayarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Genetik veya farmakolojik koşullar genelinde ekzon kullanımını ve poliadenilasyon bölgesi dağılımını karşılaştırarak izoform düzenlemesi hakkındaki hipotezleri test edin.
- Tarama: Fenotipik veya hedef bazlı analizlerde güvenilir bileşik etkisi değerlendirmesini destekleyen standartlaştırılmış, kantitatif ekzon ve ekleme (splicing) olayı metrikleri oluşturun.
- Analizler: Koşulları objektif bir şekilde karşılaştırmak için doğrusal modellemeden (voom, lmfit, eBayes) ve olay bazlı araçlardan (rMATS, diffSplice) ampirik istatistikler, p-değerleri ve etki büyüklükleri elde edin.
- Translasyonel Araştırma: Risk ayarlı ilerleme kararlarını destekleyerek, preklinik modellerdeki ekleme ve poliadenilasyon değişikliklerini gen düzeyindeki fenotiplerle ilişkilendirin.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: R Markdown tabanlı protokolü; genetik modelleri, ilaç tedavilerini veya hastalık dokularını inceleyen projeler genelinde yeniden kullanılabilir bir biyoinformatik yetkinlik olarak konuşlandırın.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Geleneksel gen düzeyindeki diferansiyel ekspresyon analizlerinde gözden kaçan izoform spesifik düzenleyici katmanlar çözümlenerek mekanistik belirsizlik azaltılır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış normalizasyon (CPM, calcNormFactors), filtreleme eşikleri ve doğrulanmış Bioconductor paketleri (limma, edgeR, rMATS, maser) aracılığıyla tekrarlanabilirlik sağlanır.
- Stratejik Değer: İzoform düzeyinde hedef modülasyonuna dair erken kanıtlar sunarak, geç aşama biyolojik yıpranma riskini azaltır ve go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Ortogonal yöntemler (ekzon tabanlı ve olay tabanlı) genelindeki uyumlu splicing ve poliadenilasyon kanıtlarına dayanarak, hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- R/Bioconductor kullanarak RNA-seq analizi, doğrusal modelleme ve ekleme (splicing) olaylarının yorumlanması konularında biyoinformatik uzmanlığı gerektirir.
- Hizalanmış BAM dosyalarına, gen anotasyonuna (GTF) ve standart RNA-seq ön işlemeden elde edilen sayım matrislerine bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için filtreleme kriterlerinin (örneğin, ≥3 örnekte CPM >1) ve istatistiksel eşiklerin (FDR <0.1, ΔPSI ≥10%) ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Sayım metriklerinin alternatif ekleme ve poliadenilasyon iş akışlarına uygulanması sırasında parametrelerin (örneğin, örtüşme ayarları, türler arası bilgiler) uyarlanmasını içerir.
- Düşük bolluktaki izoformları tespit etmek için yeterli sekanslama derinliği ihtiyacı ve hesaplamalı öngörülerin ortogonal yöntemlerle (örneğin, PCR, uzun okuma sekanslama) doğrulanmasının önemi gibi pratik sınırlamaları kapsar.
