Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Bu prosedürün genel amacı, hücre kültüründeki ayrı plakların sayılması yoluyla enfektif varionların miktarının belirlenerek viral konsantrasyonun saptanmasıdır. Bu işlem, öncelikle enfeksiyon için konfluent bir monokatman oluşturacak şekilde hücrelerin ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, miktarı belirlenecek olan bilinmeyen viral örneğin seri dilüsyonunun yapılmasıdır. Ardından, konfluent monokatmanlar viral stokun seri dilüsyonları kullanılarak enfekte edilir ve ardından immobilize eden bir örtü tabakası uygulanır. Son adım, ayrı plakları sayabilmek için söz konusu virüs için uygun inkübasyon süresinden sonra plakların fikse edilmesi ve boyanmasıdır. Sonuç olarak, plak analizleri, bilinmeyen bir viral örneğin viral titresi belirlenmek amacıyla birçok farklı şekilde kullanılabilir ve modifiye edilebilir.

Bu tekniğin yarı katı overlay gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hem yüksek kapasiteli hem de geleneksel uygulamalarda uygulama ve kaldırma işlemlerinin çok daha basit olmasıdır. Ayrıca, reaktiflerin ısıtılmasına gerek yoktur. Bu tekniğin etkileri, birçok farklı litik virüs araştırmasına kadar uzanmaktadır; çünkü 96 kuyucuklu formatta sıvı overlay kullanımı, yeni terapötik bileşiklerin hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanır ve bu da geleneksel plak analizleri gerçekleştirirken laboratuvarda harcanan uzun saatleri önemli ölçüde azaltabilir.

Analizden bir gün önce, enfeksiyon gününde %90 ila %100 konfluens düzeyine ulaşmak için söz konusu virüs için uygun hücreleri ekim yapın. Stok çözeltiler de analizden bir gün önce hazırlanabilir. İlk olarak, 5,56 mililitre %36'lık stok formaldehiti 14,44 mililitre distile su ile karıştırarak distile suda %10'luk bir fiksasyon çözeltisi hazırlayın. Ardından, %20 etanol içinde %1 kristal viyole içeren ve distile su ile seyreltilmiş kristal viyole boyasını hazırlayın. Sonra, steril koşullar altında çalışarak, kullanılan hücre tipi için uygun 2x plak medyasını hazırlayın. Reaktiflerden herhangi biri steril değilse, çözeltiyi 0,2 mikronluk bir filtreden geçirin. Plak analizinde kullanılacak sıvı örtü katmanını hazırlamak için, manyetik karıştırıcı ile hızla karıştırılan 97,6 mililitre distile su içeren bir balona 2,4 gram Avicel ekleyin. Çözeltiyi, manyetik karıştırıcı için çok viskoz hale gelene kadar oda sıcaklığında karıştırın. Bu noktada, balonu bir çalkalayıcıya aktarın ve homojenizasyonu sağlamak için 30 dakika boyunca şiddetli şekilde çalkalayın. Son olarak, çözeltiyi 121 °C'de 14 PSI basınçta 30 dakika boyunca otoklavlayın.

Program sona erdiğinde, sızdırmaz şekilde oda sıcaklığında saklayın. Agaroz kaplama için, distile su içerisinde %0,6'lık bir agaroz stok çözeltisi hazırlayın, bir karıştırma çubuğu ile karıştırın ve çözünür hale getirmek için otoklavlayın. Karboksimetilselüloz kaplama için, distile su içerisinde %2'lik bir karboksimetilselüloz çözeltisi hazırlayın ve karıştırın. Ardından, daha önce olduğu gibi otoklavlayın.

Ekimi takip eden gün, analize başlamadan önce hücrelerin konfluensini ve canlılığını kontrol etmek için ters mikroskop kullanın. Hücrelerin standart hücresel morfoloji sergilediğinden ve yaklaşık %90 konfluensten emin olun.

Söz konusu virüsün beklenen titresi temelinde gerekli dilüsyon sayısını değiştirerek, enfektif örneklerin hücresel büyüme ortamında on katlık seri dilüsyonunu gerçekleştirin. Ayrıca, hücresel canlılığı bağımsız olarak doğrulamak ve plak tanımlamaya yardımcı olmak için enfekte edilmemiş bir kontrol örneği hazırlayın. Monotabakayı bozmamaya dikkat ederek, enfekte edilmemiş kontrolü ve seri dilüsyonları plaka kuyucuklarına pipetleyin.

Viral kontak oranını maksimize etmek için hacmi mümkün olduğunca düşük tutarak, hücreleri kaplayacak yeterli miktarda inokülüm kullanın. Plakaları doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreleri 45 dakika ile bir saat arası enfekte edin. Eşit dağılımı sağlamak ve hücresel monokatmanın kurumasını önlemek için plakaları her 20 dakikada bir nazikçe sallayın.

Enfeksiyon sırasında, sıvı örtü katmanları için çalışma çözeltisini hazırlayın. 0,6 ila 1,2% Avicel örtü ortamı çalışma çözeltisi elde etmek için, ısıtılmış plak medya ile oda sıcaklığındaki %1,2 ila 2,4'lük Stok Avicel'i birer bir oranda karıştırın. Agaroz veya CMC örtü katmanları için, ısıtılmış plak medyayı, ısıtılmış %0,6'lık agaroz veya %2'lik CMC stok çözeltisi ile birer bir oranda karıştırın. Ardından, sıcaklık dengelenmesi için 30 dakika boyunca 56 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Hücre ölümünü ve viral titrenin azalmasını önlemek için çözeltinin ılık olduğundan ancak dokunulduğunda sıcak olmadığından emin olun. Enfeksiyondan sonra, örtü katmanlarını enfekte edilmiş tek katmanlı hücrelere uygulayın. Örtü katmanı eklendikten sonra, plakları analiz edilen virüse bağlı olarak iki ila 14 gün boyunca 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin.

Hücreleri sıvı bir örtüyle sabitlemek için Avicel örtüsünü dökün veya aspire edin, ardından kuyucuklara %10'luk formaldehit çözeltisi pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakikadan gece boyunca kadar sabitleyin. Agaroz veya CMC için formaldehit çözeltisini doğrudan örtünün üzerine ekleyip oda sıcaklığında bir saatten gece boyunca kadar bekletin. Sabitleme işleminden sonra formaldehiti atın ve ardından agaroz için yarı katı tıkaçları spatula ile manuel olarak çıkarın.

Boyama işleminden önce, kalıntı overlay tespit ediciyi uzaklaştırmak için Avicel hücre plaklarını suyla durulayın.

Boyamak için hücrelerin üzerini yaklaşık 15 dakika boyunca minimum miktarda kristal viyole çözeltisi ile kaplayın. Eşit kapsama sağlamak için gerekirse plakaları sallayın. Kristal viyole boyasını su ile nazikçe yıkayarak temizleyin. Fiksasyon, boyama ve kurutma işlemleri tamamlandıktan sonra, plakları gelecekteki analizler için süresiz olarak saklayın. Beşten az veya 100'den fazla plağı olan kuyucukları hariç tutarak her kuyucuktaki plakları sayın. Aynı dilüsyonun teknik tekrarları için ortalamayı alın. Plak boyutunu ve morfolojisini not edin. Bir dilüsyon için ortalama plak sayısını ve toplam dilüsyon faktörünün tersini alarak stok örneğin viral titresini belirleyin.

Bu görüntü, 12 kuyucuklu plaklar kullanılarak yapılan Rift Vadisi ateşi virüsü plak örtme karşılaştırmalarını göstermektedir. Vero hücreleri, 12 kuyucuklu plakalara 2,5 x 10⁵ hücre olacak şekilde ekilmiş ve MP 12'nin aynı seri dilüe edilmiş başlangıç örneğinden 200 µL kullanılarak enfekte edilmiştir. Enfeksiyon sonrası, örtme yöntemlerini doğrudan karşılaştırmak için 1,5 mL'lik 0,3% agaroz, 0,6% Avicel veya 1% CMC örtmeleri uygulanmıştır. Bu histogram, üç örtme yönteminin tamamı için plak sayımı ve titrasyon sonuçlarını göstermektedir. Burada, 12 kuyucuklu plaklar kullanılarak yapılan VEEV plak örtme karşılaştırmaları gösterilmektedir. Vero hücreleri daha önce olduğu gibi ekilmiş ve VEEV-TC 83 vaccine strain'in aynı seri dilüe edilmiş başlangıç örneğinden 200 µL hacminde kullanılarak enfekte edilmiştir; enfeksiyon sonrası, daha önce olduğu gibi 1,5 mL'lik 0,3% agaroz, 0,6% Avicel veya 1% CMC örtmeleri uygulanmıştır.

Tekrar, histogram üç kaplamanın tamamı için plak sayımı ve titrasyon sonuçlarını göstermektedir. Bu görüntü, yüksek kapasiteli plak kaplamalarına bir örnek sunmaktadır. Kuyuk başına 3 x 10⁴ hücre olacak şekilde ekilen Vero hücreleri içeren 96 kuyucuklu bir plak, Rift Valley fever virus MP 12'den hazırlanan aynı seri seyreltilmiş başlangıç örneğinin 50 µL'lik inokulumu ile dört paralel şeklinde bir saat boyunca enfekte edilmiştir. Kaplamalar için, sıvı kaplamaların yüksek kapasiteli bir şekilde kullanılmasının fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini belirlemek amacıyla Avicel hücresinin %0,6 ve %1,2 nihai konsantrasyonları denenmiştir. Bu histogram, her bir kaplamadan belirlenen titreleri göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, her virüsün farklı olduğunu ve farklı hücre tiplerinin, inkübasyon sürelerinin ve/veya büyüme ortamlarının kullanılması dahil olmak üzere optimizasyonların gerekli olabileceğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hem sıvı hem de yarı katı kaplamalar kullanılarak temel bir plak assay'inin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.