Fenotiplendirme Fare Solunum Fonksiyon İn Vivo Akciğer Yayıcı Kapasite
6 Ocak 2015
Farelerde akciğer yayılma kapasitesini hızlı ve basit bir şekilde ölçmenin bir yolunu tarif ediyoruz ve bunun birden fazla yaygın akciğer patolojisindeki fenotip değişikliklerine yeterince duyarlı olduğunu gösteriyoruz. Bu nedenle bu metrik, fare modellerine doğrudan öteleme ilgisi getirir, çünkü yayılma kapasitesi insanlarda da kolayca ölçülür.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, kalibre edilmiş bir gaz kromatografı kullanarak bir farenin akciğerlerinin yayılma kapasitesinin nasıl ölçüleceğini öğrenmektir. Bu, anestezi uygulanmış bir farenin akciğerlerinin neon ve karbon monoksit içeren gazla şişirilmesi, gazın akciğerlerde dokuz saniye tutulması ve gazın toplanmasıyla gerçekleştirilir. Akciğerlerden çekilen gaz daha sonra iki mililitreye seyreltilir ve gaz kromatografına enjekte edilir.
Akciğerdeki neon ve karbon monoksitin diferansiyel alımı, yayılma kapasitesini hesaplamak için kullanılır. Bu ölçüm, geniş bir akciğer hastalığı modelleri yelpazesinde akciğer fonksiyon kaybını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin, farede solunum fonksiyonunu ölçmek için mevcut diğer tüm yöntemlere göre temel avantajı, bunun insanlarda benzer ölçümlerle doğrudan karşılaştırılabilen çok basit, tekrarlanabilir bir ölçüm olmasıdır.
Bu yöntem, çeşitli akciğer patolojileri ile ortaya çıkan akciğer yapısındaki değişiklikleri takip etmek için kullanılabilir. Bu protokol, nitrojen, oksijen, neon ve karbon monoksit tepe noktalarını ölçmek için makineyle birlikte verilen gaz kromatograf modülünün kurulmasıyla başlar. Bu uygulama için sadece neon ve karbon monoksit verilerine ihtiyaç vardır.
Cihaz, taşıyıcı gaz olarak helyum içeren bir moleküler elek sütunu kullanır. Bu özel gaz kromatografı 0.8 mililitrelik bir kolona sahiptir ve başlamadan önce bu kolonun yeterli şekilde temizlenmesini sağlamak için iki mililitrelik bir numune kullanılır. Bir dizi ölçüm, makineyi her zaman doğrudan gaz numune torbasından iki mililitre gaz kullanarak kalibre eder.
Ortaya çıkan ilk tepe neon, daha sonra bu prosedür için ölçmediğimiz oksijen ve nitrojendir. Son olarak, karbon monoksit zirvesi, gaz kromatografının zamanı olarak görünür. Tüm bu zirveleri ölçmek bir dakikadan biraz daha azdır.
Başlamak için, fareleri ketamin ve ksilazin ile uyuşturun. Bir ayak parmağı tutamına yanıt olarak refleks hareketinin olmaması ile anesteziyi onaylayın. Gözleri korumak için daha sonra veteriner merhemi sürün, ardından fareleri bir studen kanülü ile trakeostomi yapın.
Yetişkinler için 18 gauge kanül veya çok genç fareler için 20 gauge kanül kullanın. Ardından, metronomu her saniye sesli tıklamalarla başlatın. Altı haftadan daha eski fareler için, gaz karışım torbasından 0,8 mililitre gaz çekmek için üç mililitrelik bir şırınga kullanın.
Fare dört haftadan küçükse, 0,4 mililitre gaz kullanın, ardından şırıngayı trakeal kanüle bağlayın ve akciğerleri hızla şişirin. Metronom tıklamalarıyla senkronize olarak zihinsel olarak birden 10'a kadar saymaya başlayın. Sayım 10'a ulaştığında, 0,8 mililitrelik hacmi hızla geri çekin.
Solunan bu gazı en az 15 saniye oda, hava ve ağırlık ekleyerek iki mililitreye seyreltin. Akciğerleri mümkün olduğunca çabuk şişirmek ve söndürmek çok önemlidir. Hızlı bir şişirme çok kolaydır, ancak 0.8 mls'yi hızlı bir şekilde hassas bir şekilde geri çekmek biraz pratik gerektirir, ardından tüm numuneyi gaz kromatografına enjekte edin.
Analiz için, hayvana ve hayvandan gaz kromatografına aktarılırken numunenin kontaminasyonunu önlemek önemlidir. Bu, GC numuneyi ölçerken işareti bir parmakla kapatarak dikkatli bir şekilde yapılabilir. Fare akciğerini torbadan başka bir 0,8 mililitre gaz karışımı ile şişirin ve ardından bu numuneyi ilkiyle aynı şekilde işleyin.
İki ölçümden elde edilen ortalama değerleri kullanarak DFCO'yu hesaplayın. C alt simgesi, kalibrasyon gazlarını ifade eder ve dokuz alt simge, hayvandan toplanan numuneleri ifade eder. Dokuz saniyelik nefesten sonra tutun.
C 57 siyah altı fareden alınan nominal kontrol DFCO değeri yaklaşık 0.77'dir. PR sekiz influenza modeli kullanılarak yapılan bir çalışmada, elastaz kurulumundan 21 gün sonra amfizem modelinde altıncı ve sekizinci günlerde ilerleyici bir fonksiyon kaybı görülmüştür. DFCO orta derecede azaldı, ancak Blio Mycin kurulumunun neden olduğu fibroz modelinde çok daha büyük değişiklikler oldu.
Bleomisinin neden olduğu fibrotik yol, patolojik modellerin herhangi birinde gözlenen DFCO'daki en büyük değişikliğe neden oldu. Bu önemlidir, çünkü yayılma kapasitesi aynı zamanda insanlarda fibrozun güvenilir bir belirtecidir. CFTR geni, kistik fibrozda çok önemli bir rol oynar ve bu genin eksik olduğu fareler üzerinde yapılan bir çalışmada, DFCO'da önemli bir azalma olmuştur.
DFCO, bu nakavt farelerde mantar enfeksiyonu ile daha da azaldı. Akciğer hasarı için yaygın olarak kullanılan bir model LPS'den kaynaklanır. LPS'ye maruz kalan farelerde, DFCO ölçümleri ile değerlendirildiği gibi bir günden dördüncü güne kadar ilerleyen zamana bağlı akciğer fonksiyon kaybı olmuştur, DFCO ölçümü iki haftalık kadar genç farelerde başarılı bir şekilde yapılabilir.
Akciğerin daha küçük boyutu, 0,4 mililitrelik daha küçük bir şişirme hacmi gerektirir. Bu daha küçük hacimle ölçülen DFCO, bir kez ustalaştıktan sonra akciğer olgunlaştıkça beklenen artışı gösterebilir. Bu teknik, diğer herhangi bir solunum fonksiyon ölçümü veya değerlendirmesi yapmadan önce fare başına sadece birkaç dakika içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, şişirme ve indirme adımının hızlı bir şekilde gerçekleştirildiğinden emin olmak ve kontaminasyonun önlenmesi için numuneyi aktarırken dikkatli olmak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kalibre edilmiş bir gaz kromatografı kullanılarak farelerde akciğer difüzyon kapasitesinin ölçülmesi için kullanılan bir yöntemi açıklamaktadır. Bu teknik, çeşitli akciğer patolojilerindeki fenotip değişikliklerine karşı hassastır ve bu yönüyle translasyonel araştırmalar için uygundur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Solunum Fizyolojisi
- Translasyonel Araştırma
Arka Plan
- Akciğer difüzyon kapasitesi, pulmoner fonksiyonun kritik bir ölçümüdür.
- Farelerde akciğer fonksiyonlarını ölçmek için kullanılan mevcut yöntemler karmaşık olabilir.
- Translasyonel uygunluk açısından fareler ve insanlar arasında karşılaştırmalı çalışmalar yapılması esastır.
- Etkili araştırmalar için basit ve tekrarlanabilir tekniklere ihtiyaç duyulmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Farelerde akciğer difüzyon kapasitesini ölçmek için basit bir yöntem geliştirmek.
- Çeşitli akciğer hastalığı modellerinde akciğer fonksiyon kaybını değerlendirmek.
- Fareler ve insanlar arasındaki pulmoner fonksiyon ölçümlerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Anestezize edilmiş fare akciğerlerinin neon ve karbonmonoksit içeren bir gaz karışımı ile şişirilmesi.
- Toplama işleminden önce gazın dokuz saniye boyunca akciğerlerde tutulması.
- Toplanan gazın analiz için iki mililitreye seyreltilmesi.
- Gazların farklı tutulum miktarlarını ölçmek için bir gaz kromatografının kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, akciğer difüzyon kapasitesinin güvenilir bir ölçümünü sağlar.
- Çeşitli patolojilerle ilişkili akciğer fonksiyonlarındaki değişimlere karşı duyarlıdır.
- Teknik basit ve tekrarlanabilirdir, bu da araştırmalardaki uygulanabilirliğini artırır.
- Sonuçlar, insanlardaki benzer ölçümlerle doğrudan karşılaştırılabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, fare modellerinde akciğer fonksiyonlarının değerlendirilmesi için değerli bir araç sunmaktadır.
- Fareler ve insanlar arasındaki ölçümleri birbirine bağlayarak translasyonel araştırmaları destekler.
- Gelecekteki çalışmalar, akciğer patolojilerini daha etkili bir şekilde incelemek için bu tekniği kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Farelerde akciğer difüzyon kapasitesinin ölçülmesi, insan klinik verileriyle doğrudan karşılaştırmaya olanak tanıyan translasyonel bir pulmoner fonksiyon testi sağlar. Bu yaklaşım, akciğer hastalığı modellerinin fenotipik karakterizasyonunu destekler ve preklinik hedef doğrulamasında öngörülebilir güveni artırır. Yöntemin basitliği ve tekrarlanabilirliği, mekanistik risk azaltma ve portföy önceliklendirmesi için keşif iş akışlarına entegrasyonu kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Amfizem, fibrozis, akut akciğer hasarı ve enfeksiyon modellerinde akciğer fonksiyon kaybını nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Murin akciğer patolojisi çalışmalarında fonksiyonel hedef doğrulaması için hızlı ve tekrarlanabilir bir analiz yöntemi sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Akciğer yapısı ve fonksiyonu üzerindeki bileşik etkilerini taramak için uygun, gaz değişimine dayalı kantitatif okumalar sağlar.
- Operasyonel Değer: 1 dakikadan kısa süren okuma süresine sahip standartlaştırılmış prosedür, keşif süreçlerinde yüksek kapasiteli fenotipik taramaları destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İnsan difüzyon kapasitesi ölçümleriyle uyumlu olup, türler arası biyobelirteç hizalamasına ve translasyonel sürekliliğe olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Preklinik modellerde erken dönem fonksiyonel değişiklikleri tespit ederek, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, fare modelleri ile insan klinik son noktaları arasında fenotipik bir köprü sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Fonksiyonel gaz değişim metrikleri aracılığıyla yapısal akciğer değişikliklerini saptayarak hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış gaz toplama ve neon ile karbonmonoksit alımının kromatografik analizi sayesinde assay hazırlığına olanak tanır.
- Analitikler: Farklı deneysel koşullar ve zaman noktaları arasında akciğer fonksiyonlarının karşılaştırılmasına imkan veren kantitatif difüzyon kapasitesi (DFCO) değerleri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Difüzyon kapasitesi ölçümlerinin doğrudan karşılaştırılabilirliği yoluyla murine fenotipleri ile insan klinik alakası arasında bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hastalık modeli ve çalışma evresi boyunca boylamsal akciğer fonksiyonu izlemesi için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kantitatif fenotipleme yoluyla akciğer patolojisi modellerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Hızlı gaz enjeksiyonu, nefes tutma ve GC analiz iş akışı aracılığıyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Geç evre biyolojik riskleri azaltan, erken ve translasyonel açıdan ilgili fonksiyonel okumalar sağlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hastalık modellerinde akciğer fonksiyonlarının korunması veya iyileştirilmesine dayalı olarak bileşiklerin risk tabanlı önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Fare anestezisi, trakeal kanülasyon ve gaz işleme tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Moleküler elek kolonlu ve helyum taşıyıcı gazlı, kalibre edilmiş bir gaz kromatografına erişime bağlıdır.
- Gaz hacimleri, şişirme zamanlaması ve numune seyreltme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Akciğer boyutu ve gerekli gaz hacimleri nedeniyle (0,4 mL'ye karşı 0,8 mL), neonatal ve yetişkin fareler için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Transfer sırasında numune kontaminasyonunun önlenmesi gerekliliği ve doğru ölçümler için akciğerlerin hızlıca şişirilip söndürülmesinin önemi gibi pratik sınırlamaları kapsar.
