Bakteriyel Transkriptom Analizi Vaka çalışması için A Hızlı ve Güvenilir Boru Hattı: Serin bağımlı Gen Yönetmelik Streptococcus pneumoniae

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir koşul altında meydana gelen bakterilerdeki transkriptomik değişikliklere genel bir bakış sağlamaktır. Bu, ilk olarak bakteri hücrelerinin belirli bir koşul altında büyütülmesi ve hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, hasat edilen hücrelerden toplam RNA izole edilir ve RNA'dan CDNA yapılır.

Daha sonra CDNA'lar etiketlenir ve şirket içi yapılan mikro tahlil slaytlarına hibritlenir. Son olarak, slayt yıkanır, ardından slaytlar taranır ve analiz edilir. Sonuç olarak, mikrodizi, belirli koşullar altında bakteri hücrelerindeki transkriptomik değişiklikleri göstermek için kullanılır.

DNA mikroarray teknolojisinin, QPCR veya northern blotting gibi gen ekspresyonunu incelemek için mevcut diğer yöntemlere göre ana avantajı, belirli bir koşul altında meydana gelen tüm transkriptomik değişikliklere küresel bir genel bakış sağlamasıdır. Hızlı, güvenilir ve nispeten ucuzdur. Prosedürü gösteren, moleküler genetik laboratuvarımdan PSD öğrencileri Mohammed Sal ve Airon Manzu olacak Çözüldükten sonra, s pmo, ED 39 hücre peletleri ve Resus, metin protokolüne göre 400 mikrolitre te içinde süspanse edildikten sonra, aşağıdakileri RNA içermeyen vidalı kapaklı tüplerde hazırlayın, 0.5 gram cam boncuk, 50 mikrolitre %10 SDS, 500 mikrolitre önceden hazırlanmış fenol kloroform ve yeniden askıya alınmış hücre peletleri.

Hücreleri kırmak için, tüpleri bir boncuk çırpıcıya yerleştirin ve her biri 60 saniye boyunca iki kez homojenize edin, darbeler arasında bir dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin, ardından numuneleri 10.000 Gs ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Üst fazı yeni bir tüpe aktarın ve 500 mikrolitre kloroform i, a, a ve beş dakika daha santrifüjleyin. Üst fazdan taze tüplere 500 mikrolitre pipetleyin.

İki hacim lizis bağlayıcı tampon ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra bir RNA izolasyon kiti kullanarak, kirletici DNA'yı RNA'dan çıkarmak için üreticinin protokolünü izleyerek toplam RNA'yı izole edin. Bir karışımdan 100 mikrolitre D a ekleyin ve 15 ila 25 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe edin.

Temizlenmiş RNA'yı yıkamak için RN a'nın kitini kullanın ve 300 mikrolitrelik PCR tüplerinde diz çökme reaksiyonunu gerçekleştirmek için 50 mikrolitrelik bir hacme Elute edin. Toplam RNA'yı iki mikrolitre rastgele monomerle karıştırın ve hacmi 18 mikrolitreye çıkarmak için gerekirse nükleaz içermeyen su kullanın. Diz çökmüş bir karışımı 70 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Daha sonra reaksiyonları oda sıcaklığında 10 dakika soğutun ve tüpleri en az bir dakika buzun üzerine yerleştirmeden önce hızlı bir şekilde döndürün. CDNA'yı ters çevirmek için, ters transkripsiyon karışımını hazırlayın, karışımın 18 mikrolitresini 12 mikrolitre ana karışımla birleştirin ve reaksiyonu 42 santigrat derecede iki ila 16 saat inkübe edin. Üç mikrolitre 2.5 molar ve bir OH ekleyerek mRNA'yı reaksiyondan ayırın ve yaklaşık 15 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Daha sonra NAOH'yi nötralize etmek için 15 mikrolitre iki molar yığın serbest asit ekleyin. Ardından, CDNA'yı bir spektrofotometre ile saflaştırmak için PCR temizleme sütunlarını kullandıktan sonra, CDNA'yı etiketlemek için CDNA konsantrasyonunu ölçün. Mikrolitre CDNA başına 20 ila 60 nanograma beş mikrolitre ortalama reaktif boya ekleyin.

Karışımı karanlık ve inkübe edilmiş oda sıcaklığında 60 ila 90 dakika bekletin, ardından PR temizleme kolonlarını kullanmadan önce 50 mikrolitre evrim tamponunda 50 mikrolitre evrim tamponunda sızan CDNA etiketli boyayı saflaştırmak için, etiketli CDNA konsantrasyonunun toplam 50 mikrolitre hacimde mikrolitre başına en az 0,5 piko mol olduğundan emin olun. Utangaç tamponu hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, tamponu en az 30 dakika boyunca 68 santigrat derecede önceden ısıtın. Numuneyi hazırlamak için eşit miktarda etiketli CDNA'yı birleştirin, ardından hacmi yedi mikrolitre veya daha azına düşürmek için yüksek sıcaklıkta vakum yoğunlaştırıcılar kullanın.

Bu arada, arka plan sinyalini azaltmak için kaldırıcı kızaklarını temizlemek için sabun ve bol musluk suyu kullanın, ardından kaldırıcı kızaklarını fön çektikten sonra %100 etanol kullanın, beyaz Teflon astarı aşağı bakacak şekilde bir kaydırağa yerleştirin. Daha sonra, kurutulmuş boya örneklerini yedi mikrolitre H2O içinde çözün ve 94 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Hemen 35 mikrolitre önceden ısıtılmış utangaç tampon ekleyin, hafifçe karıştırın ve bir dakika boyunca döndürün ve maksimum hız.

Çökeltmeleri peletlemek için, yüklemeden önce probu yaklaşık beş dakika boyunca 68 santigrat derecede önceden ısıtın. Sürgü ve kaldırıcı kızağını monte etmek için, hibridizasyon sürgü tutucusunu 50 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin. DNA mikrodizi kızaklarını kaldırıcı kızağı ile ısıtılmış hibridizasyon sürgüsü tutucusuna yerleştirin ve sürgüyü kaldırıcı kızağı ile bir dakika önceden ısıtın.

Ardından, mümkün olan en kısa sürede, slaydın sonuna 40 mikrolitre numune hedefi ekleyin. Sıvının kılcal kuvvet ile cam yüzeyler arasında akmasına izin verin. Şimdi ön ısıtma hibridizasyon kasetini hibridizasyon fırınından çıkarın ve makineyi kapatın.

Ardından, üç mililitre iki XSSC ile ıslatılmış filtre kağıdını hibridizasyon kasetine yerleştirin. Kızaklı hibridizasyon sürgü tutucusunu hibridizasyon kasetine yavaşça yerleştirin. Hibridizasyon kasetini kapatın ve tekrar hibridizasyon fırınına koyun ve 16 ila 18 saat inkübe edin.

Slaytları yıkamak için bir, iki ve üç taze yıkama tamponları hazırlayın ve 30 santigrat dereceye getirin. İnkübasyon tamamlandığında SDS'nin çözülmesini sağlamak için, slaytları mümkün olan en kısa sürede, cam tüpün dibinde durana kadar 50 mililitre yıkama tamponu ile doldurulmuş bir Falcon tüpüne hafifçe batırın. Kaldırıcı kaydıktan sonra, diziyi çizmeden borunun dibine batar, sürgüyü çıkarmak için cımbız kullanın ve yıkama istasyonunun rafına koyun.

Slaytları beş dakika boyunca yıkamak için hemen 500 mililitre yıkama tamponu kullanın. Daha sonra slaytları 20 ila 30 dakika boyunca ikinci yıkama tamponuna aktarın, ardından bunları beş dakika boyunca 500 mililitre yıkama tamponu üçe aktarın. Son olarak, mikrodizi analizi yapmadan önce slaytları 2000 RPM'de iki dakika kurutun.

L serin'in S pnömonisinin tüm transkriptomu üzerindeki etkisini incelemek için metin protokolüne göre, aynı ortamda 10 milimolar l Seine'de yetiştirilene kıyasla, 150 mikromolar L Seine ile CDM'de yetiştirilen D 39 suşunun D 39 Wildtype suş mikrodizi analizi yapıldı. Bu tablo, bu şekilde gösterildiği gibi her bir kültürden izole edilen toplam RNA konsantrasyonlarını listeler. DNA çıkarıldıktan sonra, RNA'nın kalitesi incelendi.

Bu iki şerit, 150 mikromolar Seine'den gelen RNA'yı temsil eder ve bu iki şerit, 10 milimolar Seine ile yetiştirilen kültürlerden gelir. İki şeffaf bandın varlığı, kaliteli RNA'yı gösterir. Toplam RNA'dan sentezlenen CDNA konsantrasyonları bu sütunda kaydedilir ve ortalama reaktif boya etiketli numuneler burada listelenir.

Bu şekilde ortalama reaktif kalıp oranının bir dağılım grafiği analizi görülmektedir ve gürültüyü azaltmak için veriler daha fazla analiz edilmiştir. Bu tablo, iki kat farktan büyük veya buna eşit kriterler ve 0.001'den küçük bir P değeri uygulandıktan sonra mikroarray çalışmalarının sonuçlarını özetlemektedir. Burada görüldüğü gibi, bu prosedürü takiben bir dizi gen, maksimum L serin ile karşılaştırıldığında minimum L serin varlığında farklı şekilde ifade edilmiştir.

Beag, elektrosit tahlilleri, QPCR, nakavt ve/veya ekspresyon gücü gibi diğer yöntemler, geliştirilmesinden sonra gelecek soruları cevaplamak için kullanılabilir. Bu teknik, moleküler ve hücre biyolojisi alanındaki VFR araştırmacılarına RAM pozitifteki düzenleyici ağları ve mekanizmaları keşfetme fırsatı verdi.