Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma
14 Mayıs 2015
Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.
Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerini serumsuz bir monokatman hücre kültüründe nöral bir soy hattına farklılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle kültür kabının jelatin ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, embriyonik kök hücreler farklılaştırma ortamında tek hücre süspansiyonu haline getirilir ve uygun ekim yoğunluklarına seyreltilir.
Son adımda, hücreler gel ENC kaplı plakaya ekilir. Nihayetinde, ilgili nöral belirteçlerin görselleştirilmesi yoluyla farklılaşmanın başarısını onaylamak için immünofloresan mikroskopi kullanılır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır çünkü uygun yoğunlukta ekim yapmak, başarılı bir farklılaşma elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Ekime yoğunluğunu doğrudan ve dolaylı olarak etkileyen birkaç faktör vardır. Hücreleri ekmeden önce, %1 jelatin içeren bir alikotu, çözünene kadar 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Ardından jelatini 500 mL ılık PBS ile karıştırın ve jelatin kaplama yaparken, hücre kültürü kabının tabanını yüzeyi kaplayacak kadar bu çözeltiyle doldurun.
Subkonflüen fare embriyonik kök hücre kültürünü iki kez PBS ile durulayın. Ardından kültüre bir mililitre disosiyasyon reaktifi ekleyin. İki ila beş dakika sonra, monokatmanı tek hücre süspansiyonu haline getirip yerinden çıkarmak ve kültürü toplam 10 mililitre besiyeri ve hücre disosiyasyon reaktifi içinde toplamak için kaba hafifçe vurun.
Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve santrifüjle çöktürün. Ardından, süpernatantı dikkatlice aspire ettikten sonra, peleti tüpün kenarına vurarak önceden ısıtılmış N two B 27'nin 10 mililitresi içinde yeniden süspanse edin. Kabarcık oluşumunu önlemek için, konsantrasyonu kaydederek hücreleri sayın ve tabloya göre, önceden ısıtılmış N two B 27 içerisinde her kuyucuk için birim hacim başına uygun hücre sayısında yeniden süspanse edin.
Ardından jelatini kültür kabından aspire edin ve kabı çalkalamadan hücreleri ekim yapın. Kültürleri 37 °C ve %5 karbondioksit içeren nemli bir inkübatöre yerleştirin. Besiyerini bir ila iki günde bir yenileyin.
Taze N2 B27 ile hücreler farklılaşmaya başlayacak ve dört ila altı gün içinde SOX1 ekspresyonu gösterecektir; hücreleri immunofloresan görüntüleme için boyamak üzere, kültürlerden farklılaşma ortamını uzaklaştırın ve hücreleri 500 µL %4 paraformaldehit ile fiksasyon yapın. 15 dakika sonra hücreleri iki kez 2 mL tween içeren PBS ile yıkayın ve permeabilize edin. Ardından, hücreleri bir saat inkübe ederek spesifik olmayan tüm bağlanmaları bloke edin.
Hücreler az önce gösterildiği gibi yıkandıktan sonra, plak sallayıcı üzerinde serum takviyeli bir mililitre PBS tween içerisinde bekletilir. Kültürlere, dört derece Celsius'ta plak sallayıcı üzerinde gece boyunca inkübasyon için 500 mikrolitre beta üç tubulin karşıtı fare IgG eklenir. Ertesi gün.
Hücreleri yıkadıktan sonra, örnekleri floresan işaretli anti-US IgG sekonder antikoru ile oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak ve sallayarak bir saat boyunca inkübe edin. Hücreleri tekrar durulayın ve 500 microliters DPI ile beş dakika boyunca boyayın. Son olarak, hücreleri son bir kez daha yıkadıktan sonra, dört degrees Celsius'ta iki haftaya kadar PBS tween içinde saklayın.
Görüntüleme yapılana kadar. Bu deneyde, nöral farklılaşmayı takip etmek için endojen SOX1 GFP raporlu fare embriyonik kök hücreleri kullanılmıştır. Altıncı günde, hücreler fikse edilmiş ve nöronal marker beta 3 tubulin için boyanmıştır.
Optimal yoğunlukta hücreler nöral öncüllere ve nöronlara farklılaşırken, daha yüksek yoğunlukta ekim yapılması SOX1 GFP ve beta three tubulin pozitif hücre sayısının azalmasıyla sonuçlanmıştır. Hücre kültürü kabının hacmi de optimal ekim yoğunluğunu etkilemektedir. Örneğin, 96 kuyucuklu plakada büyütülen hücreler, bunun yaklaşık 10 katı daha yüksek bir hücre yoğunluğu gerektirir.
Hücreler, optimal ve iki konfluens hücre yoğunluğuna ulaşmak için altı kuyucuklu bir kültür kabına ekilmiştir. Diferansiyasyon sırasında, embriyonik kök hücreler morfolojilerini kademeli olarak değiştirirler. Örneğin, bu görüntülerde, optimal hücre yoğunluğunda ekimden sonraki birinci ile altıncı günler arasındaki hücre ve koloni morfolojisi gözlemlenebilir.
Dördüncü günde, SOX1 GFP raporundan gelen yeşil floresan sinyalin ortaya çıkmasıyla kanıtlandığı üzere, hücreler nöral progenitörlere dönüşmeye başlar. Altıncı güne gelindiğinde ise hücrelerin çoğu SOX1 pozitiftir. Bazı nöral olmayan hücrelerin bulunması beklense de, bu videoyu izledikten sonra fare embriyonik kök hücrelerinin tek katmanlı hücre kültüründe nöral diferansiyasyonunun nasıl başlatılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, serumsuz monokatman yöntemini kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinin nöral öncüllere farklılaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu yaklaşım, olgun nöral hücre tiplerinin üretilmesine olanak tanır ve bileşik taraması için çok kuyucuklu format ölçeklendirmesine uygundur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Kök Hücre Araştırmaları
Arka Plan
- Embriyonik kök hücreler çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilir.
- Nöral progenitörler, nöral gelişimin incelenmesi için gereklidir.
- Serumsuz kültür yöntemleri tekrarlanabilirliği artırabilir.
- Başarılı bir farklılaşma için uygun ekim yoğunluğu kritiktir.
Çalışmanın Amacı
- Nöral progenitörlerin üretimi için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- Nöral spesifikasyon süreçlerinin incelenmesini kolaylaştırmak.
- Nöral diferansiyasyonu etkileyen bileşiklerin yüksek çıktılı taramasını sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kültür kaplarının jelatin ile kaplanması.
- Embriyonik kök hücrelerden tek hücre süspansiyonu oluşturulması.
- Hücrelerin jelatinle kaplanmış plakalara ekilmesi.
- Diferansiyasyon başarısını doğrulamak için immünofloresan mikroskobunun kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Embriyonik kök hücrelerin nöral öncüllere başarılı şekilde diferansiyasyonu.
- Nöral belirteçlerin görselleştirilmesi diferansiyasyonu doğrular.
- Etkili diferansiyasyon için optimal ekim yoğunluklarının belirlenmesi.
- Yöntem, bileşik tarama uygulamaları için ölçeklendirilebilir niteliktedir.
Sonuçlar
- Serumsuz monokatman yöntemi, nöral progenitör üretimi için etkilidir.
- İmmünofloresan, diferansiasyonu değerlendirmek için güvenilir bir tekniktir.
- Bu protokol, nörobilimdeki çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu protokol, nörobilim ilaç keşfinde erken aşama hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltmayı destekleyerek, tanımlanmış, serumsuz bir monokatman sisteminde fare embriyonik kök hücrelerinden ölçeklenebilir nöral progenitor üretimine olanak tanır. Yöntem, bileşiklerin nöral diferansiyasyon üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tekrarlanabilir ve kantitatif bir platform sağlayarak, ön klinik süreçlerde öncü bileşik tanımlamasını ve öngörülebilirlik güvenini kolaylaştırır. Reporter hatları ve yüksek yoğunluklu kültür formatlarıyla uyumluluğu, yolak modülasyonu ve hedef etkileşim çalışmaları için tarama iş akışlarına entegrasyona imkan verir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Yönlendirilmiş farklılaşma yoluyla nöral belirleme mekanizmalarının sorgulanmasına ve nörogelişimsel hedeflerin fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Deneyler ve hücre hatları genelinde değişkenliği azaltan ve tekrarlanabilirliği artıran, tanımlanmış, serumsuz bir sistem sağlar.
- Öngörücü Değer: Bileşik kaynaklı nöral öncül hücre verimi ve marker ekspresyonundaki değişimlerin değerlendirilmesini destekleyerek, hedef etkileşimi ve yolak modülasyonu hakkında bilgi sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşik tarama ve nöral farklılaşmanın fenotipik değerlendirmesi için uygun, homojen bir nöral progenitör popülasyonu oluşturur.
- Operasyonel Değer: Ölçeklenebilir ekim yoğunluğu optimizasyonu ile çok kuyucuklu formatlara (örneğin, 96 kuyucuklu) uyarlanabilir; orta ve yüksek kapasiteli uygulamalara olanak tanır.
- Analiz Hazırlığı: Farklılaşma verimliliğinin ve marker ekspresyonunun çok parametreli analizi için immunofloresans, akış sitometrisi ve moleküler okumalarla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Nöral progenitör üretiminden fonksiyonel nöron ve glia olgunlaşmasına kadar ilerlemeye olanak tanıyarak hastalığa özgü modellemeyi destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Nöral spesifikasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için reporter hatlarını (örneğin, SOX1-GFP) kullanarak soy taahhüdü ve diferansiyasyon dinamiklerinin çalışılmasını kolaylaştırır.
- Preklinik Yararlılık: Bileşiklerin nöral olgunlaşma ve glial diferansiyasyon üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini sağlayarak güvenlik farmakolojisi ve etki mekanizması çalışmalarını destekler.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, nöral farklılaşmanın mekanistik sorgulaması yoluyla hedef doğrulamayı destekleyerek ve nörobilim portföylerinde bileşik taraması için assay geliştirmeyi mümkün kılarak erken keşif sürecine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Yönlendirilmiş farklılaşma ve marker tabanlı okumalar aracılığıyla nörogelişimsel yolların hipotez testlerini ve hedef validasyonunu destekler.
- Tarama: Monolayer kültürde assay standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar; burada ekim yoğunluğu, tutarlı nöral progenitor üretimi için kritik bir parametredir.
- Analitikler: Farklılaşma verimliliğini ve bileşik yanıtını ölçmek için immünofloresan (örneğin, SOX1-GFP, βIII-tubulin) ve akış sitometrisi yoluyla kantitatif çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Erken nöral progenitor üretimini, fonksiyonel nöron ve glialara dönüşen alt olgunlaşma süreçleriyle ilişkilendirerek preklinik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tanımlanmış ve ölçeklenebilir protokol; birden fazla ESC hattı, kültür kabı ve tarama kampanyası genelinde yeniden kullanımı destekleyerek yeniden geliştirme çabasını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöral farklılaşma yollarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş, serumsuz koşullar, farklı laboratuvarlar ve hücre hatları arasında tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Bileşiklerin nöral soy taahhüdü ve farklılaşma verimliliği üzerindeki etkilerinin erken değerlendirilmesine olanak tanıyarak devam/dur kararlarına temel oluşturur.
- Portföy Etkisi: Mekanistik risk azaltma ve yolak doğrulama yoluyla nörobilim hedeflerinin risk odaklı önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Kök hücre kültürü, farklılaşma teknikleri ve immünofloresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- CO2 inkübatörlerine, santrifüjlere, mikroskoplara ve jelatin, N2B27, disosiyasyon reaktifleri ve antikorlar gibi reaktiflere erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilirliği sağlamak için kullanıcılar ve merkezler arasında ekim yoğunluğunun ve jelatin kaplama prosedürlerinin standartlaştırılması gereklidir.
- Farklı ESC hatlarına veya reporter konstrüktlarına adaptasyon; ekim yoğunluğunun ve farklılaşma zamanlamasının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, ekim yoğunluğuna karşı hassasiyet ve topaklanmayı veya eksik tek hücre süspansiyonunu önlemek için dikkatli monokatman disosiyasyonu ihtiyacı yer alır.
