Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerini motor nöronlara farklılaştırmaktır. İlk olarak fare embriyonik kök hücrelerini, primer fare embriyonik fibroblastları üzerinde kültüre edin ve lösemi inhibitör faktörü ile destekleyin. Ardından noggin, BFG F ve FGF sekiz ekleyerek nöralizasyon sürecini geliştirin; ardından retinoik asit ve smoothened agonisti ile inkübasyon yaparak motor nöron spesifikasyonunu indükleyin ve bu işlemi akson uzaması ile motor nöron maturasyonu ile takip edin.

Son olarak, güçlü GFP floresansı gösteren diferansiye olmuş MES hücrelerini incelemek için immünofloresan mikroskopi kullanın. Büyük miktarlarda motor nöron üretimi, mevcut protokollerle karşılaştırıldığında motor nöron hastalıkları üzerine yapılan araştırmaları kolaylaştırmıştır. Fare embriyonik kök hücrelerini motor nöronlara diferansiye etmenin bu yaklaşımı daha verimlidir. Bu yöntem, spinal müsküler atrofi hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntem, amyotrofik lateral skleroz gibi diğer motor nöron hastalıklarına da uygulanabilir. Primer embriyonik fare fibroblastlarını ekmek için, dört adet 100 milimetrelik doku kültürü kabını sekiz mililitre %0,1'lik jelatin çözeltisi ile kaplayın. Oda sıcaklığında 30 dakika beklettikten sonra fazla sıvıyı boşaltın. Şimdi, bir viyali mitomisin C'yi aktif PMEF içinde 40 mililitre PMEF besiyerinde seyreltin, dört kaba ekleyin ve bir haftaya kadar kültüre edin.

Ardından, bir viyal MES hücresini 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün. Hücreleri 15 mL'lik bir tüp içerisinde beş mL E ES besiyeri ile yıkayın. 800 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjledikten sonra.

Süpernatantı aspire edin ve MES hücrelerini, yeni eklenmiş lösemi inhibitör faktörü içeren 20 mililitre ES besiyerinde yeniden süspande edin. PMEF kültürlerinden 10 mililitre besiyerini uzaklaştırıp yerine 10 mililitre HBG üç ES hücre süspansiyonu ekleyerek işleme devam edin. Ekime başladıktan 24 saat sonra küçük koloniler şeklinde olan, 72 saat sonra ise çapları yaklaşık 100 mikrometreye ulaşan MES hücrelerinin zaman içindeki gelişimini izleyin.

MES hücrelerinin indüksiyonu için hücre proliferasyonunu sürdürmek amacıyla besiyerini günlük olarak değiştirin. Motor nöronlara farklılaşma. Fare embriyonik kök hücreleri önce PMEF feeder hücrelerinden ayrılmalı ve ardından indüksiyon gününde süspansiyon ortamında kültüre edilmelidir.

Her 100 milimetrelik ES kültürü için, %0,1 jelatin ile kaplanmış bir T 25 flask hazırlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika beklettikten sonra, fazla jelatini uzaklaştırın ve PBS ile üç kez yıkayın. Gevşek şekilde tutunmuş kolonileri yerinden oynatmamaya dikkat ederek, ES kültüründeki medyumun dikkatlice aspire edilmesine devam edin. Ardından 10 mililitre PBS ile bir kez yıkayın.

MES hücrelerini PMEF'den ayırmak için üç mililitre %0,25 trypsin EDTA ekleyin ve üç ila beş dakika inkübe edin. 37 °C'de, kök hücrelerin ve PMEF'lerin plakadan ayrıldığını doğrulayın. Ardından 15 mililitre taze ES medyumu ekleyin ve pipetleme yaparak kolonileri dağıtın.

Hücre süspansiyonunu hazırlanmış jelatin kaplı T one 50 flask'a aktarın ve PFS'nin jelatinize yüzeye tutunması için 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Şimdi, yüzen MES hücrelerini 50 ml'lik bir tüpe toplayın ve santrifüjle peletleyin. Hücreleri 10 ml nöral diferansiyasyon ortamında yeniden süspande edin.

Besiyerini bir hemositometre kullanarak sayın ve ardından diferansiyasyon için 100 milimetrelik süspansiyon kültürü kabına aktarın. Birinci gün, mikroskopi ile MES hücrelerinin embriyonik cisimler adı verilen küçük yüzen agregatlar oluşturduğunu doğrulayın. Kaba tutunmuş herhangi bir taşıma PMEF riskine karşı, ES süspansiyon hücrelerini ve besiyerini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından 500 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Embriyonik gövdeleri toplamak için medyumu dikkatlice aspire edin, peletlenmiş EBS'lere 10 mililitre taze nöral diferansiyasyon medyumu ekleyin ve ardından hücreleri yeni bir bakteriyel kültür kabına aktararak diferansiyasyon için 24 saat boyunca kültüre edin. İkinci günde, kültür kabını dairesel hareketlerle sallayın ve medyumu ve EBS'leri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. EBS'lerin yer çekimi ile çökmesini bekleyin, ardından medyumu dikkatlice aspire edin ve EBS'leri 10 mililitre motor nöron diferansiyasyon medyumunda yeniden süspande edin.

EBS kültür ortamını, farklılaşma için beş gün boyunca yeni bir bakteri kabında inkübe edin. Yedinci günde, EBS'lerin çapının yaklaşık 150 ile 200 µm olduğunu ve farklılaşma üzerine güçlü GFP sinyalleri verdiğini doğrulayın. EBS'leri disosiye etmeden iki gün önce, yani beşinci günde, 24 kuyucuklu bir plakanın tabanına 12 mm'lik yuvarlak lameller yerleştirin.

Ardından 0,5 mL 100 µg/mL poly DL ornithine ekleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Poly DL ornithine'i aspire edin, plakları ve lamelleri doku kültürü kabininde hava ile kurutun. Plak kuyucuklarını üç kez çift distile su ile durulayın.

Lamel kaplamaları için havada kurumasını bekleyin. Buz gibi soğuk 1X PBS içerisinde, mililitre başına iki mikrogram fare laminini içeren taze bir seyreltme hazırlayın. Kuyucuk başına 0,5 mililitre ekleyin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.

Farklılaşma aşamasında PBS ile iki kez yıkayın. Yedinci günde, EBS'yi 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve EBS'nin yerçekimi ile çökmesini bekleyin. PBS ile dört yıkamanın ardından, EBS'ye 1 mililitre ACU max ekleyip nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin, ardından EBS'yi örten fazla ACU max'ı aspire edin.

Şimdi üç mililitre MND besiyeri ekleyin ve bir mililitrelik einor mikro pipet kullanarak yaklaşık 20 kez pipetleyerek EBS'yi ayrıştırın, ardından oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin ve hücre süspansiyonunu bir hücre süzgeci başlığı aracılığıyla 12 by 75 milimetrelik bir tüpe aktarın. Nihai altı mililitrelik tek hücre süspansiyonundaki tek hücre verimini artırmak için, filtrede kalan hücreler ve kümelerle bu ayrıştırma adımını tekrarlayın. Tek hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın; hücreleri, mililitre başına 2 × 10⁵ hücre yoğunluğuna ulaşacak şekilde komple MND besiyeri ile seyrelterek ekim yapın.

Poly DL ornitin laminin kaplı lameller içeren hazırlanan 24 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 0,5 mililitre hücre süspansiyonu eklenir. Diferansiye olan hücreler iki gün sonra uzun nöritler uzatır. Kültürde, HBG three, tanımlanmış bir diferansiyasyon protokolüne sahip, motor nöron spesifik bir promotör olan HB nine kontrolü altında EGFP eksprese eden transgenik bir fareden türetilmiş bir ES hücre hattıdır.

MES hücreleri, motor nöronlar türetmek için kullanılabilir. Diferansiye olmamış MES hücreleri, bir fibroblast besleyici tabakanın üzerinde yuvarlak koloniler oluşturur. Bu hücreler zayıf GFP ekspresyonuna sahiptir.

Bu MES hücreleri, feeder tabakalardan ayrılmış ve embriyonik cisimler oluşturmak amacıyla düşük tutunmalı kaplarda kültüre edilmiştir. Diferansiye olmuş MES hücreleri, yedinci günden sonra güçlü GFP floresansı göstermiştir. Diferansiye EBS'ler disosiye edilmiş ve poli DL ornitin laminin kaplı plaklara ekilmiştir.

Kültürde iki gün geçirdikten sonra farklılaşmış hücreler, ekili hücrelerin hücre gövdelerinden uzun nöritler uzatır; MES hücresinden türetilen motor nöronlar, immünofloresan boyama ile karakterize edilebilir. Bu GFP pozitif hücreler, pan-nöronal belirteç nörofilament ile iki motor nörona özgü belirteci ifade eder. Eyelid one ve kolin asetiltransferaz, çekirdekleri boyayan DPI ile birlikte değerlendirilir.

İki aşamalı farklılaşma protokolümüz, MES hücrelerini spinal motor nöronlara farklılaştırmak için verimli bir yöntem sunmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, fare embriyonik kök hücrelerinin motor nöronlara nasıl verimli bir şekilde farklılaştırılacağı konusunda bilgi sahibi olmalısınız. Sonuç olarak, yüksek kaliteli fare embriyonik kök hücrelerinin, motor nöronların verimli bir şekilde üretilmesi için en kritik parametre olduğunu unutmayın.