En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Bu metodolojinin genel amacı, anatomik özelliklerin kantitatif analizlerinin nasıl yapılacağını göstermektir. Drosophila larvalarının çizgili kasları ile çekirdeklerin morfolojisini, boyutunu ve konumunu etkileyen fenotiplerin nicelleştirilmesi gösterilmiştir. Hücre içi organellerin morfolojisini, büyüklüğünü ve dağılımını kontrol eden moleküler mekanizmayı anlamak, modern biyolojinin en önemli sorularından biridir.

Geçmişte, deney grupları arasındaki ve içindeki morfolojik farklılıklar sadece nitel analize tabi tutulurdu. Burada, kaslar içindeki çekirdeklerin boyutunu, şeklini ve dağılımını kontrol eden genleri tanımlamak için drosophila genetiğini morfometrik kantitatif analizle birleştiren kantitatif analizde öneriyoruz. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olmak, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Leire Ledahawski olacak.

Larva nöromüsküler kavşaklarını metin protokolüne göre diseksiyon ve boyama işleminden sonra, numuneleri 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünden çıkarmak için forseps kullanın ve bunları bir işleme slaytına koyun. Mikro diseksiyon makası kullanarak filetoların başını ve kuyruğunu kesin ve iç yüzeylerini yukarıda tutun. Şimdi, bir santimetre aralıklarla temiz bir sürgünün etrafına üç şerit selüloz bant sararak bir montaj sürgüsü hazırlayın.

Kapak kızağını, numuneleri düzleştirmemesi için sağlanan bu boşluğun üzerine koyun. Ardından, selüloz bant şeritleri arasına yaklaşık 20 mikrolitre montaj ortamı bırakın ve ortamı temiz forseps ile etrafına yayın. Şimdi fazla dokuyu hazırlıklardan çıkarın.

Parçalanmış larvaları işleme slaytından montaj slaytına ve iç yüzeyi yukarıda tutarak montaj ortamına sürükleyin. Ardından, havanın sıkışmasını önlemek için dikkatli olarak nazikçe bir kapak fişi uygulayın. Daha sonra slaytı şeffaf oje ile kapatın ve görüntülemeden önce slaytın en az 10 dakika kurumasını bekleyin.

Bu analiz için, DeVAP antikorları, lamin antikorları ve bir nükleer belirteç ile boyanmış larva vücut duvarı kaslarını gösteren konfokal görüntüler kullanın. Ardından konfokal Z yığını görüntülerini arenaya sürükleyip bırakın. Bir araç çubuğu simgesiyle erişilen Surpass görünümünde otomatik olarak açmak için resimlere çift tıklayın.

Surpass görünümünün üç ana çalışma alanı paneli vardır. Görünüm alanı, Nesne Listesi ve Nesne Özellikleri alanı. Ardından, hacim olarak oluşturulmuş üç kanallı bir görüntü oluşturmak için 3D Görünüm simgesine tıklayın.

Ardından Nesneler araç çubuğundan Yeni Ölçü Noktaları Ekle'yi seçin ve Nesne Özellikleri alanındaki Oluşturma Sihirbazı'nı izleyin. Önce Düzenle sekmesini seçin ve ardından Belirli Kanal'dan çekirdekleri vurgulamak için nükleer işaretleyiciyi veya lamin kanalını seçin. Ardından, Escape sekmesine basarak işaretçiyi Seçim moduna ayarlayın ve ardından görüntüde belirli bir çekirdeği içerecek şekilde fare tekerleğiyle 3B imleç kutusunun boyutunu ayarlayın.

Shift tuşunu basılı tutarak ve aynı çekirdeğe sol tıklayarak bir ölçüm noktası ekleyin. Ardından, aynı tekniği kullanarak aynı kasın yakındaki bir çekirdeğine ikinci noktayı ekleyin. İki nokta arasına otomatik olarak bir çizgi çizilecek ve iki çekirdek arasındaki mesafe istatistiksel bir değişken olarak görüntülenecek ve kaydedilecektir.

Belirli bir çekirdeği çevreleyen tüm çekirdekler için prosedürü tekrarlayın. Ardından, İstatistik Ayrıntılı Mesafe Verileri altında bulunan toplanan tüm ölçüm noktalarından en kısa mesafeyi seçin. Nesne Özellikleri alanı altında, Sekme Görüntüsüyle İstatistikleri Dosyaya Aktar seçeneğini belirleyin.

Bu, verileri bir elektronik tabloya kaydeder. Bu analiz için, çekirdeği görselleştirmek için lamin ve bir nükleer işaretleyici ile boyanmış vücut duvarı kaslarının konfokal görüntülerini kullanın. Myonuclei'nin şeklini değerlendirmek için, nükleer yüzey alanını aynı hacme sahip bir küreninkiyle karşılaştıran küreselliklerini ölçün.

Alternatif olarak, prolate, oblate veya elipsoidleri ve sferoidleri ayırt eden eliptikliği ölçün. Görüntüyü daha önce açıklandığı gibi açın. Ardından, Nesneler araç çubuğu simgesine tıklayın Yeni Yüzeyler Ekle.

Nesne Özellikleri alanında görünen Oluşturma Sihirbazı'nda, çekirdekleri görüntülemek için kaynak kanal olarak nükleer işaretleyici boyamayı seçin. Mutlak Yoğunluk seçeneğini eşik olarak ayarlayın. Eşik eğrisindeki değeri değiştirerek çekirdeklerin çoğunun düzgün, aşırı yüklenmemiş bir işleme gösterdiğinden emin olun.

Aynı zamanda, herhangi bir çekirdeğin deliklerinin veya eksik maskelerinin varlığından kaçının. Ardından, yüzey oluşturmadaki paraziti gidermek için Filtre aracını kullanın. Yeni oluşturulan yüzey katmanının Düzenle sekmesi altında, yanlış görüntülenen çekirdek yüzeylerini bölün.

Başka bir seçenek, yanlış işlenmiş çekirdek yüzeylerini birleştirmektir. Yüzey oluşturulan çekirdeklerin eliptiklik ve küresellik değerleri İstatistikler sekmesi altında mevcuttur. Bu verileri analiz için dışa aktarın.

Bu protokol için, nükleer bir belirteç ve lamin ve DeVAP'a özgü antikorlarla boyanmış vücut duvarı kaslarını bildiren konfokal görüntüler kullanın. Ana Menü öğesinden ilgilendiğiniz görüntüyü açın Düzenle ve ardından 3D'yi Kırp. Önceki bölümde anlatıldığı gibi lamin kanalını kullanarak Yüzey Oluşturma Sihirbazı'nı izleyin.

Yüzey oluşturulduktan sonra, Nesne Özellikleri alanında Düzenle'ye tıklayın ve çekirdeğin içindeki bir sinyali izole etmek için Tümünü Maskele'yi seçin. Ardından, DeVAP sinyalini seçin. Kanal Seç açılır menüsünden, Set Voxels Ouside the Surface seçeneğine tıklayın ve bu değeri sıfır yapın.

Bu, Görüntü Ayarlaması penceresinde kullanılabilen yeni bir maskelenmiş kanal oluşturur. Çekirdeğin içindeki sinyalin varlığını görselleştirmek için, Nesneler araç çubuğundan Yeni Kırpma Düzlemi Ekle simgesine tıklayarak bir kontur düzlemi oluşturun. Ardından, sinyalin çekirdek içindeki dağılımını görselleştirmek için kırpma düzleminin açısını ve konumunu etkileşimli olarak ayarlayın.

İnsan ile ilişkili protein B'deki yanlış anlamlı mutasyonlar ALS patogenezinde rol oynar. Açıklanan yöntem kullanılarak, mutasyon V2601'e neden olan ALS'yi barındıran sinek ortolog geni DeVAP'ı eksprese eden çizgili kaslar, karşılaştırılabilir vahşi tip DeVAP seviyelerini veya daha yüksek vahşi tip DeVAP seviyelerini ifade eden kontrollerle karşılaştırıldı. Kas lifleri boyunca çekirdeklerin dağılımını değerlendirmek için en yakın komşu analizi kullanıldı.

Mutasyona uğramış DeVAP transgenini eksprese eden kontrol kasları veya vahşi tip proteini aşırı eksprese eden kaslarla karşılaştırıldığında, ilgilenilen mutasyon, çekirdekler arasındaki ortalama en kısa mesafede dramatik bir azalmaya neden oldu. Daha sonra, çekirdeğin küreselliği incelendi. Çekirdek aralığını azaltan transgenlerin aynı zamanda çekirdek hacmini de büyüttüğü bulundu.

Çekirdeklerin 3D rekonstrüksiyonları ve hacim görüntüleri, ilgilenilen mutasyonu ifade eden kasların çekirdeklerde lokalize kümeler oluşturduğunu ortaya çıkardı. Bu yöntem aynı zamanda mitokondri gibi diğer organellerle ilişkili morfolojik özelliklerin kantitatif analizine de genişletilebilir. Nükleer mimari, konum ve boyuttaki değişiklikler yaşlanma ve Parkinson hastalığı ve ALS gibi bir dizi nörodejeneratif bozuklukla ilişkilendirilmiştir.

Dispraksisin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, etkili terapötik müdahaleler için yeni farmakolojik hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir.