Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, kültürdeki tek hücrelerde anti-kanser terapötik yanıtı gözlemlemektir. Bu yöntem, heterojen terapötik yanıt ve hücre kaderi dahil olmak üzere kanser araştırma alanındaki temel soruları cevaplayabilir. Başlamak için, sertifikalı bir steril laminer akış başlığı altında, HT1080 hücrelerini metin protokolüne göre kültür sertifikalı kaplarda hazırlayın ve hücreleri nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.

Görüntülemeden iki gün önce, 12 oyuklu, no. 1.5 cam tabanlı bir tabağın istenen sayıda kuyucuğuna kuyu başına 50.000 HT1080 FuGENE hücresi yerleştirin. Deneyin başlangıcı için yaklaşık% 60 birleşme elde etmek için büyüme hızlarına ve kullanılan çanağa bağlı olarak kaplanan hücre sayısını ayarlayın.

Numune konumundaki sıcaklık 80 santigrat dereceye ayarlandığında çevre odasını yaklaşık %37 neme ayarlayın. Su haznesinin, üreticinin talimatlarına göre steril damıtılmış su ile doldurulduğundan emin olun. Ardından çevre odasını istenen sıcaklık ayarına getirin ve mikroskop aşamasına yerleştirin ve ayarlayın.

Sahne üst bölmesi ile sahne içi iç kısım arasında herhangi bir boş alan varsa, odayı sahneye bağlamak için bölmeyi içine yerleştirmeden önce sahne iç açıklığının kenarlarına parafin film parçaları yerleştirin. Hazne üzerinde hiçbir bağlantının çekilmediğinden emin olun, her ikisi de hareket artefaktlarına neden olabilir. Hazneye su dolu sahte bir tabak yerleştirin ve haznenin 37 santigrat dereceye kadar dengelenmesini bekleyin, ardından sabit bir sıcaklığı koruyun.

Görüntülemeyi ayarlamak için mikroskobu, bilgisayarı ve gerekli tüm çevre birimlerini açın. Işık kaynağına bağlı olarak, ihtiyaç duyulana kadar açmak için bekleyin. Objektif tareti alçak konumdayken, 20x 0,7 sayısal diyafram açıklığına sahip objektifi seçin.

Ardından numuneyi objektifin üzerine yerleştirin, bu da numune haznedeyken hücreleri bulmayı kolaylaştıracaktır. Görüntülenecek hücreleri çevre odasına aktardıktan sonra, metin protokolüne göre, sabit bir ortam sağlamak için odayı kapatın ve atmosferik gazı açın. Ardından, maruz kalma sürelerini sınırlayarak ve daha düşük yoğunluklu ışık kullanarak foto toksisiteyi önleyecek görüntüleme koşullarını seçin.

X, Y ve Z düzlemlerini ve görüntülenecek her konum için istenen dalga boylarını bulmak için. Çoğu hücresel işlemin uzun süreli zaman atlaması için, her on ila yirmi dakikada bir görüntü elde edin. Daha fazla zaman çözünürlüğü, daha fazla veri noktası ve daha sağlam hücre takibi sağlar, ancak daha entegre ışığa maruz kalma ve daha büyük veri kümeleri ile sonuçlanır.

HT1080 FuGENE dinamik yeşil ve kırmızı floresan proteinlere sahip olduğundan, aşağıdaki maruz kalma sürelerini kullanın ve ikiye iki kutu kullanın. Gelişmiş ayarlar altında, varsayılan ayarları kullanarak yazılım kontrollü otomatik odaklamayı etkinleştirin. Önerilen adım boyutuyla 10 mikrometrelik bir otomatik odaklama aralığı tanımlayın.

Deney kabında, termal kaymayı azaltmak için, ortamın yarısını, 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış istenen ilacı içeren ortamla değiştirin. Son olarak, zaman atlamasını başlatın ve metin protokolüne göre görüntüler elde edin. Bu filmler, kinesin-5'i inhibe eden ve mitotik arrest ile sonuçlanan bir anti-kanser ilacı ile tedavi edilen, yalnızca p53 durumlarında farklılık gösteren bir çift eşleştirilmiş meme kanseri türevi MCF7 hücre hattının örneklerini göstermektedir.

Bu şekilde görüldüğü gibi, p53 stabil p53 knockdown ile uzaklaştırıldığında, mitozdan çıktıktan sonra durmak yerine, hücreler durmak yerine ikinci bir mitoz turuna girdikleri tekrarlanan döngülerden geçerler ve mitozu bölünmeden bırakırlar. Burada gösterilenler, mCherry'ye kaynaşmış kromatin markörü Histone 2b'yi ve EGFP'ye kaynaşmış beta tübülini stabil bir şekilde eksprese eden servikal karsinomdan türetilmiş Hela hücreleridir. Mikrotübül stabilize edici ilaç paklitaksol ile tedavi edildiğinde, mitoz sırasında kromozom hizalaması ve ayrışması bozulur, bu da DNA hasarına eğilimli nükleer çıkıntıların ve mikronükleusların oluşumuna neden olur.

Bu hücre hattı, CDT1 için turuncu renkte ve geminin renginde iki floresan ubikitin hücre döngüsü göstergesini kararlı bir şekilde birlikte ifade eder ve hücre döngüsü boyunca normal şekilde ilerler. Aynı hücreler CDK46 inhibitörü ile tedavi edildiğinde, hücreler G2 fazı boyunca ilerler ve normal olarak bölünür, daha sonra G1 fazında güçlü bir şekilde durur, bu da büyüyen tümörlerde afektif sitostatik etki potansiyelini gösterir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir hücre yanıtını, bu yanıtları çıkarmak yerine, birçok gün boyunca gerçek zamanlı olarak doğrudan, takip edebilmenizdir.