Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama
29 Nisan 2017
Bu makale, kütle sitometrisi analizi için örneklerin toplanmasını ve işlenmesini açıklamaktadır.
Bu numune hazırlama işleminin genel amacı, heterojen hücre popülasyonlarının sorgulanmasını sağlamak için çeşitli numunelerin sağlam ve tutarlı bir antikor boyamasını üretmektir. Bu yöntem, karmaşık bir heterojen hücre popülasyonunda hücre kimliği, hücre sinyalizasyonu ve hücre tepkisi ile ilgili soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücre düzeyinde yüksek parametreli protein seviyelerinin ölçülmesine izin vermesidir.
Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Aundrietta Duncan olacaktır. Her bir tek hücre süspansiyon numunesi için, serum içermeyen ortamda mililitre başına dört kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin, altı hücreye 2/10'da 500 mikrolitre taze hazırlanmış 50 MicroMolar Sisplatin ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında sabit karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bir dakika sonra, Sisplatin'i eşit hacimde yıkama tamponu ile söndürün ve hücreleri santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek, hücreleri santrifüjleyerek ve yıkama tamponunu dökerek numuneleri iki kez daha yıkayın. Bunu, 500 mikrolitre PBS'de iki yıkama ile takip edin, benzer şekilde numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanı atın. İkinci PBS yıkamasından sonra, peletleri 500 mikrolitre taze PBS'de tekrar süspanse edin ve hücreleri 500 mikrolitre% 4 PFA ile sabitleyin.
Karıştırmak için hücreleri pipetleyin. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sürekli karıştırarak orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin, süpernatanı dökün ve bunu taze PBS'de yıkayın.
Hücrelere nüfuz etmek için, hücreleri tekrar döndürün ve süpernatanları atın. Nazikçe girdaplama ile kalan PBS'deki numuneleri yeniden süspanse edin ve hemen nazikçe pipetleme ile altıncı hücrelere 2/10 10'da bir mililitre %100 metanol ekleyin. Numuneleri en az bir saat boyunca dört derecede inkübe edin ve inkübasyonun sonunda hücreleri santrifüjleyin.
Daha sonra metanolü boşaltın. Daha sonra peletleri her mililitre metanol için bir mililitre yıkama tamponunda yıkayın, ardından 500 mikrolitre taze yıkama tamponunda iki yıkama daha yapın. 50 mikrolitreye ayarlanmış 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, her peletten kalan yıkama tamponunu uygun karşılık gelen antikor kokteylinin bir tüpüne aktarın.
Pistonu kısmen basılı tutarak uca hava çekmeden birleşik çözeltiyi pipetleyin. Ardından pipet ucunu, pistonu serbest bırakmadan 500 mikrolitre yıkama tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Toplam 50 mikrolitrelik bir antikor kokteyli hacmi için yıkama tamponunu çekerek pistonu serbest bırakın ve uygun karşılık gelen numuneyi nazikçe pipetleme ile aspire edilmiş antikor kokteyli ile etiketleyin.
Sürekli çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat sonra, numuneleri dört kez yıkayın ve her seferinde yıkama tamponunu dökün. Hücreleri iridyum ile etiketlemek için, son peletleri 500 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 500 mikrolitre yüzde dört PFA ekleyin. Daha sonra, 500 mikrolitre taze hazırlanmış 62.5 nanomolar iridyum ve PFA'yı 15 dakika daha oda sıcaklığında çalkalamak için numunelere ekleyin.
Daha sonra hücreleri santrifüjleyin, süpernatanı dökün ve ardından 500 mikrolitre yüzde 0.1 BSA ve filtrelenmiş deiyonize suda iki yıkama yapın. Numune plakalarının kuyucuklarına normalizasyon boncukları ekleyerek, hücreleri bu kuyucuklara pipetleyerek ve ardından 24 saat içinde kütle sitometrisi gerçekleştirerek numuneleri analiz edin. Sinyal yoğunluğunun normalleştirilmesini takiben, kalibrasyon boncukları, iridyum 191 pozitif boncuk negatif popülasyonu üzerinde geçit yapılarak verilerden çıkarılabilir.
Tek hücre olayları daha sonra, olay uzunluğuna karşı iridyum 193 negatif ifadesinin çift eksenli bir grafiği kullanılarak kalıntıları ve hücre çoklarını çıkarmak için kapılanabilir. Sisplatin etiketleme, hücre derinliği miktarını ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, burada düşük ve daha yüksek miktarlarda ölü hücre içeren örnekler gösterilmektedir.
Ölü hücreler, platin 198 pozitif popülasyonun kapısını açarak çıkarılabilir, barkodlama, numunelerin barkodlama parametreleri içinde belirgin bir şekilde ayrılmasına neden olur ve hücrelerin orijinal numune kimliklerine atanmasına izin verir. IDU etiketlemesi, burada gözlemlenen ABD yüz hücrelerini tespit etmek için kullanılabilir. İlk normalleştirme, barkodlama ve geçitlemenin ardından, yüksek boyutlu veriler, verilerin görsel yorumlamaya daha uygun olan daha düşük boyutlu bir temsilini oluşturmak için SPADE algoritması kullanılarak analiz edilebilir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa dört ila altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, yıkama adımını yaparken numune kaybını en aza indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kütle sitometrisi analizi için numunelerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.
Sodyum azid ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken uygun KKD giymek gibi önlemler almalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kütle sitometri analizi için örneklerin toplanmasını ve işlenmesini açıklamaktadır. Yöntem, heterojen hücre popülasyonlarını incelemek için tutarlı antikor boyaması sağlamayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Kütle Sitometrisi
Arka Plan
- Kütle sitometrisi, tek hücre düzeyinde yüksek parametreli protein seviyelerinin ölçülmesine olanak tanır.
- Hücre kimliğini ve sinyal iletimini anlamak için faydalıdır.
- Bu teknik, karmaşık heterojen hücre popülasyonları için uygulanabilir.
- Güvenilir sonuçlar elde etmek için numune hazırlığı kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Kütle sitometrisi için bir örnek hazırlama sürecini göstermek.
- Çeşitli hücre popülasyonlarının sorgulanmasını sağlamak.
- Hücre yanıtları ve etkileşimleri hakkında bilgi sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Tek hücre süspansiyon örneklerinin serumsuz ortamda yeniden süspanse edilmesi.
- Hücre tedavisi için taze hazırlanmış Cisplatin kullanımı.
- Tutarlı karıştırma için orbital çalkalayıcıda inkübasyon.
- Tedavi sonrası hücrelerin santrifüjlenmesi ve yıkanması.
Temel Sonuçlar
- Etkili örnek hazırlama tekniğinin gösterimi.
- Örnekler genelinde tutarlı antikor boyamasının sağlanması.
- Tek hücre düzeyinde yüksek parametreli analizin kolaylaştırılması.
- Heterojen hücre popülasyonlarına dair içgörülerin elde edilmesi.
Sonuçlar
- Yöntem, karmaşık hücre popülasyonlarını analiz etme yeteneğini artırır.
- Doğru kütle sitometrisi sonuçları için sağlam örnek hazırlığı kritik öneme sahiptir.
- Bu teknik, hücre biyolojisi ve nörobilim alanındaki araştırmaları ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Kütle sitometrisi, yüksek parametreli tek hücreli protein analizine olanak tanıyarak ilaç keşfinde heterojen hücre popülasyonlarının derinlemesine incelenmesini destekler. Hedef doğrulaması ve mekanistik risk azaltma süreçlerine temel teşkil eden tutarlı ve tekrarlanabilir verilerin üretilmesi için güvenilir numune hazırlığı esastır. Bu protokol, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin erken keşif iş akışlarındaki değişkenliği azaltmalarına ve öngörücü güveni artırmalarına yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Karmaşık dokulardaki hücresel kimliği ve sinyal durumlarını aydınlatmak için multipleks protein profilleme imkanı sağlar.
- Operasyonel Değer: İlaç hedef etkileşiminin ve yolak modülasyonunun tek hücre çözünürlüğünde, hipotez odaklı incelenmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Farklı hücre tiplerinde bileşik etkilerini değerlendirmek için standartlaştırılmış, yüksek boyutlu okumalar üretir.
- Operasyonel Değer: Analiz ölenebilirliği ve deneyler arası karşılaştırılabilirlik için kritik olan tekrarlanabilir boyama ve fiksasyon prosedürlerini oluşturur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilgili modellerde biyobelirteç keşfini ve fenotipik karakterizasyonu kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Preklinik ilerlemedeki devam/durdurma kararlarını desteklemek için hücresel yanıtların boylamsal takibini sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, toplu analizleri ve fonksiyonel taramaları tamamlayan, kantitatif ve tek hücre çözünürlüğünde veriler sunar.
- Keşif Biyolojisi: Pertürbasyonlara yanıt olarak hücresel heterojenliğin ve dinamik protein ekspresyon değişimlerinin ayrıntılı haritalanmasını sağlar.
- Tarama: Hit doğrulaması ve etki mekanizması çözümlemesi için uygun, çoklu ve kantitatif çıktılar sunar.
- Analitik: Doğru yorumlama için hesaplamalı kapılama (gating) ve normalizasyon gerektiren yüksek boyutlu veriler üretir.
- Translasyonel Araştırma: Örnek setleri arasında tutarlı immünofenotipleme sağlayarak preklinik modellerle uyumlanmayı destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde yeniden kullanılabilir kütle sitometri platformları için standartlaştırılmış bir örnek hazırlama temeli oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kapsamlı, tek hücre çözünürlüklü protein profilleme yoluyla öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış yıkama, sabitleme ve permeabilizasyon basamakları aracılığıyla tekrarlanabilirliği artırır ve teknik değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Karmaşık örneklerdeki biyolojik belirsizliği azaltarak hedef seçimini ve öncü bileşik optimizasyonunu iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Keşif sürecinin erken aşamalarında hedef dışı etkileri ve hücre durumuna özgü yanıtları ortaya çıkararak veri odaklı önceliklendirmeyi sağlar.
Uygulama Hususları
- Akış sitometrisi prensipleri, antikor paneli tasarımı ve metal konjugatlı reaktiflerin kullanımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- Örneklerin tutarlı bir şekilde işlenmesi için bir kütle sitometresi, santrifüj ekipmanı ve orbital çalkalayıcılara erişime bağlıdır.
- Seriler arası tutarlılığı sağlamak için reaktif hazırlama, özellikle Cisplatin ve metanol bazlı permeabilizasyon işlemleri için standart işletim prosedürlerini gerektirir.
- Protokolün primer dokular, kan veya kültüre edilmiş hücreler gibi çeşitli örnek türlerine uygulanması sırasında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Çoklu yıkama basamakları sırasında meydana gelen örnek kaybı ve arka plan sinyalini en aza indirmek için antikor kokteyllerinin dikkatli titrasyonu ihtiyacı ile ilgili pratik kısıtlamaları kapsar.
