Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Bu prosedürün genel amacı, canlı dokudaki alt popülasyonlar ve/veya bireysel nöronlar üzerinde kalsiyum görüntüleme deneyleri gerçekleştirmek için fare RO burun organının veya VNO'nun akut doku dilimi preparatını oluşturmaktır. Bu işlem, önce VNO'nun farenin burnundan çıkarılması ve ardından bir diseksiyon mikroskobu altında soğuk A CSF içerisinde kıkırdak kapsülünden mikro diseksiyonla ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, izole edilen VNO bir agar bloğuna dikey olarak yerleştirilir ve doku bütünlüğünü doğrulamak için bir mikrotom kullanılarak akut koronal doku dilimleri kesilir.

İmmünohistokimya sonrası birkaç kesit konfokal mikroskop altında incelenir. Diğer kesitlere kalsiyum duyarlı bir boya yüklenir ve ardından olası feromon ligandları ile perfüzyon uygulanarak kalsiyum görüntüleme yoluyla nöronal aktivasyon gözlemlenir. Bu yöntem, koku alma alanı ile ilgili temel sorunların çözülmesine yardımcı olabilir.

Örneğin, romo nazal organda yüzlerce feromon reseptörü eksprese edilir ancak bunların çok azının ligandları tanımlanmıştır. Feromon reseptörlerini heterolog bir sistemde eksprese etmek oldukça zordur. Belirli feromonları belirli reseptörlerle eşleştirmek için etkili bir in vivo analiz yöntemi geliştirmemiz gerekiyordu.

Belirli bir nöron alt popülasyonunun bilinmeyen reseptörler eksprese ettiği ve GFP ekspresyonu ile tanımlanabildiği taktik fareler kullanabiliriz. Ayrıca, prosedürü gösterirken, Fairmont transdüksiyon kaskadında yer alan iyon kanallarını ve enzimleri farmakolojik olarak incelemek için bu deneyi kullanabiliriz. Bugün, diseksiyona başlamadan önce laboratuvarımdan iki araştırmacı olan Julian ve Fabian bizimle olacak.

Kalsiyum klorür dışındaki tüm bileşenleri birleştirerek taze, soğuk, oxy carb ile doyurulmuş yapay beyin omurilik sıvısı (A CSF) hazırlayın. Çözeltiyi, içine doğrudan oxy carb kabarcıkları göndererek doyurun. Ardından kalsiyum klorürü ekleyin ve çift distile su ile istenen hacme tamamlayın.

A CSF çözeltisini kullanıma kadar buz üzerinde tutun. Erişkin bir fareyi ötanazi ve dekapitasyon işlemlerinden sonra, soğuk ve sürekli olarak oksijenle karbonatlanmış A CSF içeren bir Petri kabı hazırlayın. Alt çeneyi çıkardıktan sonra, fare başını Petri kabına yerleştirin.

Paleti görüntülemek için fare başını diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Ardından, mikro makasla damağın üst kısmına yatay bir insizyon yapın ve ardından damak membranını mikro diseksiyon pensiyle çıkarın. Açığa çıkan boşluğu A CSF ile hidrate edin ve temizleyin.

Nazal septumun üst ve alt kısımlarını kesin. Ardından, VNO'yu içeren nazal septumu dikkatlice çıkarın ve doğrudan temiz A CSF içerisine dikey olarak yerleştirin. Mikro diseksiyon pensi kullanarak VNO'nun iki kısmını birbirinden ayırın.

VNO'nun kıkırdaksı kapsülünü belirleyin ve ardından tüm kıkırdak parçalarının çıkarıldığından emin olarak onu hassas bir şekilde uzaklaştırın. İzole edilen VNO, kıkırdak parçaları ve disseke edilmemiş VNO burada gösterilmiştir; öncelikle %3 düşük erime noktalı agar hazırlayın ve ardından çalışma alanını gerekli araçlarla düzenleyin. Gömme kalıbını agarla doldurun ve disseke edilmiş VNO'yu daldırmadan önce sıcaklığın 41 °C'nin altında olduğundan emin olun. Koronal kesitler elde etmek için dokuyu dikey olarak konumlandırın.

Gömme kalıbını, helezon katılaşana kadar bir dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Bir dakika sonra, helezon bloğunu çıkarın, agarı parametal şeklinde kesin ve ardından mikrotom desteğine yapıştırın; koronal VNO kesitlerini soğuk bir CSF içerisinde, saniyede 0,5 milimetre hızda, 0,7 milimetre genlikte ve 100 mikrometre kalınlıkta mikrotom ile kesin.

Toplanan doku dilimlerinin yapısal bütünlüğünün doğrulanabilmesi, ardından fikse edilmesi ve sitoiskelet bileşenleri veya ilgilenilen diğer proteinler için immün boyanabilmesi amacıyla, dilimleri bir fırça ile toplayın ve soğuk A CSF ile doldurulmuş bir doku kültürü plakasına yerleştirin. Burada, mor renkteki asetillenmiş tübülin immün boyaması doku diliminin yapısal bütünlüğünü göstermektedir. Ayrıca, belirli bir feromon reseptörünün GFP ile işaretlendiği spesifik bir nöronal popülasyonun gözlemlenmesi, korunmuş nöronal morfolojiyi ortaya koymaktadır; karanlık bir odada çalışıldığında, küçük oval hücre gövdelerine ve lümen yüzeyine ulaşan, mikrovillüslerle sonlanan uzun dendritlere sahip nöronlar gözlemlenebilir.

VNO kesitlerini, yedi micromolar URA 2:00 AM ve %0,1 onic içeren soğuk A CSF yükleme çözeltisinde 37 degrees celsius'de bir saat boyunca inkübe edin. Yüklenmiş kesitleri kullanıma kadar oksikarbonasyon ile buz üzerinde muhafaza edin. Yüklenmiş lamları A CSF içeren bir perfüzyon kamarasına yerleştirmek için bir resim fırçası kullanın ve lamları bir doku kesiti sabitleyicisi ile sabitleyin.

Perfüzyon odasını bir kalsiyum görüntüleme düzeneğinin mikroskop tablasına yerleştirin ve oda sıcaklığında, oksijenle karbonatlandırılmış A CSF ile sürekli olarak perfüze edin. Yüklü VNO kesitlerini, boyaya karşılık gelen floresan dalga boylarını kullanarak gözlemleyin; bu değerler 4O2AM için 340 ila 380 nanometredir. Hücre içi kalsiyum oranı değişimlerini kaydetmek için uygun yazılımı kullanın. Kemostimülasyonu indüklemek için bir perfüzyon sistemi gereklidir.

Burada, V1R2 feromon reseptörünü eksprese eden nöron alt popülasyonunun aynı zamanda GFP eksprese ettiği bir fareden alınan vno dokusunun koronal kesiti, mor renkle gösterilen asetillenmiş tübülin proteinine karşı immün boyanmıştır. Kesitin yüksek büyütmeli görünümleri, doku bütünlüğünün korunduğunu göstermektedir. Uzun dendritlere sahip nöronların lümen yüzeyine ulaştığı görülmekte ve kalsiyum görüntüleme için dendritik yumrularda ve mikrovillüslerde yapısal protein ekspresyonu izlenebilmektedir.

FU yüklü doku kesitleri, önce kan damarından (birinci beyaz ok) başlayarak ilgi alanı olan bölgeyi belirlemek için Hoffman faz kontrastı kullanılarak görüntülenir; gözlemci yavaşça lümene (ikinci beyaz ok) ve nöroepitelyal bölgeye doğru ilerler. RO nazal nöronun oval hücre gövdesi, uzun ve ince dendriti ile (üçüncü beyaz ok) tanımlanabilir.

Lümene doğru uzanan dördüncü beyaz ok, nöronal dendritik yumruyu göstermektedir. Beşinci beyaz ok, burada 380 nanometre ile gösterilen ve feromon RA yüklü hücrelerle temas halindeki mikrovillüsleri işaret etmektedir; ardından sırasıyla 340 ve 380 nanometre ile aydınlatma yapılır ve bu floresan dalga boyu oranı, seçilen nöronlardaki (siyah, kırmızı ve mavi daireler) hücre içi kalsiyum değişikliklerine karşılık gelir. Nöronların canlılığını belirlemek için ATP kullanılır.

Seçilen üç nöron boyunca sergilenen kalsiyum yanıtlarının aralığına ve iki numaralı nöronun (kırmızı daire) bir TP'ye yanıt vermediğine, bu nedenle sonraki analizlerden çıkarılacağına dikkat edin. Ardından, doku kesitinin derinliğine bakılarak, hem idrar hem de fare feromon karışımı kullanılarak kemostimülasyon gerçekleştirilir. Hem GFP hem de V1RR2 reseptörünü eksprese eden bir nöron alt popülasyonu lokalize edilebilir.

Burada, hem GFP hem de V1RB2 reseptörü eksprese eden bir nöron, V1RB2 eksprese etmeyen bir nöronla birlikte gösterilmiştir. Her iki hücre de URA-2 AM ile yüklenmiş olup, V1RB2 eksprese eden nöron, reseptörün ligandi olan 2-hepnon perfüzyonuna yanıt olarak bir kalsiyum spike'ı göstermektedir. İlginç bir şekilde, V1RB2 eksprese etmeyen nöron da 2-hepnon'a yanıt vermekte olup, bu durum VNO'daki feromon kodlamasının karmaşıklığını ortaya koymaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, akut doku dilimi hazırlığı yapmak amacıyla fareden mar hücre organının nasıl çıkarılacağı ve mikrodiseksiyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu protokol, alternatif kalsiyum boyaları ve mikroskop kurulumları kullanılarak yapılacak fizyolojik incelemeler için de uyarlanabilir. Deneyinizde başarılar dileriz.