Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

Bu in-vivo matris jel analizinin genel amacı, endotel hücrelerin parazitlerle olan etkileşimini incelemektir. Bu matrigel analizi, araştırmacıların anjiyogenezin ana aşamalarını çalışmasına yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Ayrıca, kan damarı oluşumundaki temel adımlardan sorumlu sinyal yolaklarının yanı sıra, disfonksiyonu vasküler bozukluklara ve anjiyogenezin diğer sapmalarına yol açabilen genlerin tanımlanmasına da olanak sağlayacaktır.

Bu tekniğin temel avantajı, hem endotel hücrelerini hem de destek hücreleri olan perisitleri içeren in-vivo kan damarı oluşumunu incelememize olanak sağlamasıdır. Başlamak için, insan endotel ve parazit hücresi kültürlerini, 100 mm'lik plaklarda 10 mL uygun besiyeri ile büyütün. Hücreler %80 konfluensle ulaşana kadar besiyerini her iki ila üç günde bir değiştirin.

Hücrelerle karıştırmak için matris jel çözeltisini hazırlamak amacıyla, bir matris jel stoğunu dört santigrat derecede gece boyunca çözdürün. Ardından, uzun süreli saklama için negatif-20 santigrat derecede veya iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklanmak üzere 1,5 mililitrelik alikotlar hazırlayın. Her bir deneysel tapa için 200 mikrolitre matris jel gerekecektir.

Böylece, stoktaki tek bir tüp %25 fazlalıkla altı tıpa için yeterli miktar sağlayabilir. Çözünmüş 100x beta-FGF stokundan 15 µL ekleyerek kullanılması gereken her bir alikotu hazırlayın. beta-FGF'yi pipetleme yoluyla çözeltiyle karıştırın, ardından hücreleri eklemeden önce en az 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Bu aşamada, enjeksiyonlar için bazı 28G 1cc insülin şırıngalarını soğutun. Hücreleri kültür plaklarından toplamak için medyumu uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra, bir mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve plakları bir dakika boyunca inkübatöre geri koyun.

Ardından, hücreleri ayırmak için plakların üzerine iki mililitre kültür medyumu pipetleyin ve medyumu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Şimdi, toplanan hücrelerin konsantrasyonunu bir hemositometre kullanarak kontrol edin. Daha sonra, 15 mililitrelik tüplerde hücre alikotları hazırlayın.

Deney grubu için burada bir milyon endotel hücre ve 200.000 parazitin kombinasyonu kullanılır. Ardından, hücre alikotlarını 400g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, hesaplanan matris jel hacmini hücre peletine ekleyin ve hava kabarcıkları enjekte edilemeyeceği için köpük oluşmayacak şekilde nazik pipetleme ile karıştırın.

Şimdi, fareler enjeksiyona hazır olana kadar preparatları buz üzerinde tutun. Bir fareyi izofluran ile anestezi ettikten ve anestezi durumunu ayak parmağı sıkıştırma testiyle onayladıktan sonra, fareyi izofluran sağlayan yeniden solumasız sisteme bağlayın ve ventral tarafı aşağı gelecek şekilde ısıtma pedine yerleştirin. Şimdi her iki lateral arka bölgeden yaklaşık bir santimetrekarelik tüyü temizleyin.

Ardından, açığa çıkan cildi %70 alkol kullanarak temizleyin. Sonrasında, dört tıpa için yeterli olan bir mililitre hazırlanmış hücre solüsyonunu soğutulmuş bir şırıngaya yükleyin. Enjeksiyon yapmak için, deri altı boşluğunu belirlemek amacıyla sırt derisini kaldırın.

Ardından 200 µL'yi göğüs kafesinin arkasındaki deri altı boşluğuna yavaşça ve eşit şekilde enjekte edin ve sızıntıyı önlemek için iğneyi yavaşça geri çekin. Enjeksiyondan sonra uygulama bölgesinde bir şişlik oluşacaktır. Bölgeyi alkolle silin, ardından şişliğin daha sonra bulunabilmesi için etrafını kalıcı bir markörle işaretleyin.

Ardından, enjeksiyon işlemini farenin diğer tarafında tekrarlayın. Tüm hücreleri üç dakika içinde enjekte ettiğinizden emin olun, aksi takdirde hücreler şırıngaya yapışmaya başlayacaktır. Matris jel tıkacının deri ve kas tabakaları arasında oluşmasını, böylece tıkacın iyi bir şekil korumasını ve yayılmamasını sağlamak için enjeksiyon adımının düzgün yapılması kritiktir.

Bir sonraki fareye enjeksiyon yapmadan önce, matriksin jelleşmesi için enjeksiyon yapılan farenin bir dakika boyunca ısıtma pedinde kalmasını sağlayın. Ötanazi sonrası, fareyi operasyon tablasına yerleştirin. Enjeksiyon bölgesinde yeniden uzamış olan tüyleri temizledikten sonra, tıkaç konumunu belirleyen işaret çizgilerini bulun.

Ardından, ince cerrahi makaslar kullanarak, tapanın işaretlenmiş sınırı boyunca, cilde dik ve altındaki kas tabakasına kadar uzanan bir insizyon yapın. İşaretli sınırın çevresini dikkatlice kesin. Daha sonra, tapanın deri ve kas tabakaları arasında sıkışmış halde kaldığından emin olarak tapayı çıkarın.

Kanı temizlemek için tıkacı hemen PBS içeren küçük bir beherde durulayın. Ardından, tıkacın tamamını 25 mL %4 paraformaldehit içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Herhangi bir ajitasyon uygulamadan, oda sıcaklığında 24 saat boyunca fiksasyona bırakın.

Ertesi gün, tıkaçları 24 saat boyunca 25 milliliters 70% etanol içine aktarın. Ardından, parafin gömme işlemine geçin. Sadece endotel hücreler içeren tıkaç kesitleri, bazı damarların in-vivo ortamda 14 gün sonra konakçının kanı ile perfüze olmadığını göstermektedir.

Buna karşılık, hem endotel hücreleri hem de parazitler içeren tıkaçlar, in-vivo 14 gün sonra birçok perfüze damar sergilemektedir. Bu tıkaçlarda, yeşil renkte görülen CD31 pozitif endotel hücrelerinin hemen yanında, kırmızı renkte görülen düz kas aktin boyaması pozitif hücreler mevcuttur. Bu nedenle, parazitler yeni kan damarı oluşumunda önemli bir rol oynuyor olabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, çok sayıda hücre tipinde kullanılan kan damarı oluşumunu incelemek için bu güçlü in-vivo tekniğinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, araştırmacıların fare modellerinde vasküler biyolojinin çeşitli konularını keşfetmelerinin önünü açacaktır. Bu prosedürün ardından, gen ekspresyonundaki değişiklikler ve proteomik gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR ve Western immunoblotting gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Bu güçlü teknik, araştırmacının kan damarı oluşumu sırasında endotel hücrelerinin ve parazitlerin in-vivo olarak nasıl etkileşime girdiğini incelemesine olanak tanıyacaktır; bu, androjenezin temel bir adımıdır. Bu güçlü teknik aynı zamanda araştırmacının, diğerlerinin yanı sıra pulmoner hipertansiyon gibi vasküler hastalıkların anlaşılmasıyla ilgili olan diğer hücre-hücre etkileşimlerini incelemesine de olanak sağlayacaktır.