Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

Bu prosedürün genel amacı, in vivo bir insan vasküler ağı oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle insan kanı kaynaklı endotelyal koloni oluşturucu hücrelerin ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, her iki hücre tipi kollajen bazlı bir jel içerisinde karıştırılarak immün yetmezlikli bir fareye deri altına enjekte edilir.

Yedi gün sonra implant hasat edilir ve insan vasküler ağının oluşumu açısından değerlendirilir. Sonuç olarak, implantların içindeki insana özgü mikrodamarların varlığı histoloji ve immünohistokimya yoluyla doğrulanabilir. Bu teknolojinin, konstrüktun cerrahi implantasyonu gibi geleneksel bir yönteme göre temel avantajı, basit ve uygulanmasının kolay olması ve cerrahi müdahale gerektirmemesidir.

Bir vial E CFC'nin çözülmesiyle başlayın ve hücreleri derhal 10 mL DMEM içeren 15 mililitrelik konik tüpte seyreltin. Hücre süspansiyonunu 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini 10 mL ılık EGM two medyumunda yeniden süspanse edin. Ardından hücreleri %1 jelatin kaplı 100 milimetrelik doku kültürü plağına aktarın ve hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin.

Ertesi sabah, besiyerini ve bağlanmamış tüm hücreleri nazikçe aspire edin. Ardından, bağlanan hücreleri 10 milliliters taze E GM two besiyeri ile besleyin. Konfluent bir monotabaka oluşana kadar bu işleme önümüzdeki birkaç gün boyunca devam edin.

Ardından hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi iki mililitre tripsin EDTA ile değiştirin ve plakayı beş dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Beş dakika sonra bir mikroskop altında, plakaya hafifçe vurun ve hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.

Aksi takdirde, hafifçe sallayarak kısa inkübasyonları tekrarlayın. Hücreler tamamen ayrıldıktan sonra, hücrelere sekiz mililitre EGM iki medyum ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hücreleri sayın ve 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edin.

Şimdi hücreleri, %1 jelatin ile kaplanmış doku kültürü plaklarına santimetrekare başına 5.000 hücre ekim yoğunluğunda ekin. Hücreleri EGM two ortamında inkübe edin ve her iki ila üç günde bir EGM two ortamı ile besleyin. Bu prosedürü, dördüncü ve sekizinci pasajlar arasındaki sonraki pasajlar için tekrarlayın.

E CFC'ler kullanıma hazır olacaktır. Bu protokol, MSC'leri büyütmek için de kullanılabilir. Sadece E GM iki ortamını M-S-C-G-M ortamı ile değiştirin.

Kaplanmamış bir kültür plakası kullanın. Alt kültüre alma işlemine %80 konfluensle başlayın ve santimetrekare başına 10,000 hücre ekim yoğunluğunda alt kültür yapın. Bu deney, implant başına 800,000 E CFC ve 1,200,000 MSC gerektirir.

Genellikle beş implant eş zamanlı olarak hazırlanır. Başlamak için kültür plakalarındaki hücre besiyerini aspire edin ve her bir hücre plakasını 10 milliliters PBS ile yıkayın. PBS'yi iki milliliters tripsin EDTA ile değiştirin ve plakaları hafifçe sallayarak inkübe edin.

Hücrelerin tamamı ayrılana kadar her iki ila beş dakikada bir mikroskop altında kontrol edin. Ardından sekiz mililitre DMEM ekleyin ve hücre solüsyonunu toplayın. 15 mililitrelik konik tüpte hücreleri sayın ve beş implant için yeterli miktarda hücreyi tek bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Ardından hücreleri 1200 RPM hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Buz üzerinde fibrinojen ve kolajen fibronektin karışımını dikkatlice hazırlayın. Sonra hücre peletini buz gibi soğuk karışım içerisinde çok nazikçe yeniden süspanse edin.

Hava kabarcığı oluşumundan kaçınarak, hücre süspansiyonunu bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve kapaklı 26 gauge bir iğne takın. Hücre karışımı enjekte edilene kadar yüklü şırıngayı buz üzerinde tutun. Altı haftalık dört atimik nude immünodefisyent fareyi bir ISO florür odası kullanarak anestezi altına alın.

Fareler anestezi altına alınıp ayak parmağı sıkıştırma testine yanıt vermedikleri zaman, her bir fare için enjeksiyonlara geçin. Üst dorsal bölgeye subkutan olarak 50 µL trombin çözeltisi enjekte etmek için 30 gauge iğne kullanın. Aynı konuma 200 µL hücre karışımı enjekte edin.

26 gauge bir iğne kullanıldığında, enjekte edilen makromoleküller jelleşecek ve deri altında küçük ancak fark edilebilir bir şişlik oluşturacaktır. Enjeksiyondan sonra, fareleri konfor ve sıcaklık sağlamak amacıyla bir gazlı bez tabakasının üzerine yerleştirin. Hareket edebilene kadar onları gözlemleyin.

Sonraki üç gün boyunca hayvanın genel sağlık durumunun günlük gözlemini yapın. Enjeksiyonlardan bir hafta sonra fareleri karbondioksit ile ötanize edin ve jel tıpalarını cerrahi olarak çıkarın. Çıkarılan jel tıpalarının bir cetvel yanındayken fotoğraflarını çekin, ardından her bir jel tıpasını histolojik bir kasete yerleştirin ve oda sıcaklığında gece boyunca %10 nötral tamponlu formaline daldırın.

Ertesi gün, %10 nötr tamponlu formalinle yıkama yapıp distile su ile uzaklaştırın. Kasetleri, histolojik değerlendirme yapılana kadar dört derece Celsius'ta PBS içerisinde saklayın. Parafine gömülmüş implanttan yedi mikron kalınlığında kesitler alın.

Ardından implantların orta kısmındaki mikro damarların yoğunluğunu nicelleştirin. Mikro vasküler damarların insan kaynaklı doğasını kanıtlamak için H&E boyama yardımıyla milimetrekare başına düşen damar sayısını belirleyin. Kesitleri, ticari olarak temin edilebilen bir anti-human CD 31 antikoru ile 1:100 dilüsyonda boyayın.

Bu faz kontrast görüntüsü, kordon kanı kaynaklı e CFC'lerin tipik konfluent monokatmanındaki endotel hücrelerinin karakteristik parke taşı morfolojisini göstermektedir. Bu görüntü, insan kemik iliği kaynaklı MSC'lerin tipik iğ şeklinde morfolojisini göstermektedir. Fare konakçıda bir haftalık inkübasyonun ardından, sarı kesikli çizgiyle işaretlenen implant, yüksek büyütmede konakçının dokularından oldukça farklı görünmekteydi.

Sarı ok uçlarıyla belirtilen çok sayıda mikrodamarda, eritrositler içeren lüminal yapılar görülmüştür. Tıkaçlar immünohistokimyasal olarak incelendiğinde, mikrodamarların lümeninin insan CD 31'e özgü monoklonal antikora karşı reaktif olduğu saptanmıştır. Hücre çekirdekleri hematin ile karşıt boyanmıştır.

Bu teknolojiye hakim olunduğunda, doğru şekilde uygulandığı takdirde bir ons içerisinde tamamlanabilir.