Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Bu yöntemin genel amacı, floresan aralıklı bir tahlil kullanarak zar proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu ölçmektir. Bu tekniğin ana avantajı, akış sitometrisi tahlillerinin tek bir deneyde büyük hacimli canlı hücreler üzerinde ölçülebilir uç noktalar sağlamasıdır. Bu tekniğin sonuçları, kardiyak ventriküler aritmilerin teşhisi ve tedavisine kadar uzanır, çünkü bu patolojiler genellikle kardiyak iyon kanallarının kaçakçılığında kusurlara neden olan genetik mutasyonlarla ilişkilidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, protein fonksiyonlarına zarar vermeyen ve konjuge antikorun varlığında güçlü bir floresan sinyali üreten epitop için uygun bir dışsal yerleştirme yeri belirlemek için mücadele ederler. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Benoite Bourdin olacak. Başlamak için, hücre içi C-terminalinde mCherry ile DNA yapılarını çift etiketleyin.

Ayrıca, zar proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu tahmin etmek için bir floresan antikoru kullanılarak ölçülebilen, ekstra hücresel bir bakan hemmaglutinin epitopunu eksprese edin. Daha sonra, %90 birleşmeye ulaşana kadar standart teknikler kullanarak bir TSA201 hücre plakası kültürleyin. Her numune için transfeksiyon reaktiflerini iki tüpte hazırlayın.

Dört mikrogram DNA ve 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı içeren bir 1.5 mililitre tüp ve 10 mikrolitre lipozom aracılı transfeksiyon reaktifi ve 250 mikrolitre serum indirgenmiş kültür ortamı içeren ikinci bir tüp hazırlayın. İki tüpü yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, birinci ve ikinci tüpün içeriğini nazikçe birleştirin ve lipozom DNA komplekslerini oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Kompleksleri kültürlenmiş hücrelere ekleyin ve kültür kabını hafifçe sallayın. Çanağı tekrar 37 santigrat dereceye ve 24 saat boyunca %5 karbondioksit atmosferinin altına yerleştirin. Transfeksiyon reaktifinin eklenmesinden 24 saat sonra, ortamı kültür kabından çıkarın ve hücreleri 400 mikrolitre önceden ısıtılmış Tripsin-EDTA ile dikkatlice yıkayın.

Ardından, 400 mikrolitre Tripsin-EDTA ekleyin ve hücrelerin tabaktan ayrılmasını sağlamak için tabağı beş dakika inkübe edin. Ayrıldıktan sonra, hücrelere penisilin veya streptomisin içermeyen bir mililitre soğuk kültür ortamı ekleyerek enzim sindirimini durdurun. Yüzeydeki tüm hücreleri yıkamak için ortamı plakanın üzerine dört ila beş kez nazikçe pipetleyin.

Daha sonra hücreleri steril 1,5 mililitrelik tüplerde toplayın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Sonraki adımlar için, buz gibi soğuk çözelti kullanın ve yüzey epitopunun içselleşmesini önlemek için hücreleri dört derecede tutun. Ayrıca, floresan sinyalinin foto-ağartılmasını sınırlamak için hücrelerin ışığa maruz kalmasını azaltın.

Ardından, hücreleri peletlemek için tüpleri santrifüjleyin. Ardından, elde edilen süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Bir mililitre PBS kullanarak tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için peleti yeniden süspanse edin.

Ardından, tüpleri kısaca santrifüjleyin. Kültür ortamını tamamen çıkarmak için hücreleri bir kez daha pelet haline getirin ve yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre peletini 600 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Hücre konsantrasyonunu ölçün ve mililitrede en az üç milyon hücreye ayarlayın. Ardından, hücreleri yeni 1,5 mililitrelik tüplere bölün. Spesifik boyamayı spesifik olmayan boyamadan ayırt etmek ve ekstra hücresel boyamayı ve ayrıca hücre içi boyamayı ayırt etmek için uygun kontrolleri eklediğinizden emin olun.

İzotop kontrol antikoru, arka plan boyama seviyesinin değerlendirilmesine yardımcı olacaktır ve birincil antikor, uğurlu izotop ve florofor ile eşleşmelidir. Kontrol izotop antikorunun ve floresan antikorunun aynı konsantrasyonda kullanılması önemlidir. Membran proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu tahmin etmek için, önce bir floresan ışık konjuge antikor kullanarak sadece ekstra hücresel bakan HA epitopunu etiketleyin.

Daha sonra, tüpe mililitre başına beş mikrogramda FITC konjuge monoklonal anti-HA antikoru ekleyin. Hücreleri kısa bir süre vorteksleyin ve ardından karanlıkta bir külbütör platformunda kuluçkaya yatırın. Hücreleri karanlıktan çıkarın ve 900 mikrolitre PBS ekleyin.

Daha sonra hücreleri peletlemek ve süpernatanı aspire etmek için tüpü santrifüjleyin. Daha sonra, peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse ederek ve hücreleri kısaca girdaplayarak hücreleri yıkayın. Ardından, hücreleri tekrar peletlemek için santrifüj adımını tekrarlayın.

Herhangi bir bağlanmamış antikoru çıkarmak için bu yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve tek hücreli süspansiyonu beş mililitrelik bir akış sitometri tüpüne aktarın. Numune çalıştırılana kadar hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede tutun.

Toplam proteinin hücre içi ekspresyonunu tahmin etmek için, geçirgen hücreleri bir sonraki etiketleyin. Bu, hücre dışı etiketlemeye benzer bir protokol kullanılarak, ancak saponin bazlı bir hücre geçirgenleştirme tamponunun eklenmesiyle gerçekleştirilir. Hücreleri peletleyin, süpernatanı atın ve hücreleri doğrudan hazırlanan stoktan 100 mikrolitre fiksasyon geçirgenleştirme çözeltisinde yeniden süspanse edin.

Hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, 100 mikrolitre taze hazırlanmış geçirgenlik yıkama tamponu ekleyin ve hücreleri kısaca girdaplayın. Ardından, hücreleri pelet haline getirin ve geçirgenlik yıkama tamponunu kullanarak iki kez daha yıkayın.

Daha sonra, FITC konjuge monoklonal anti HA antikorunu mililitre başına 5 mikrogram ve 100 mikrolitre geçirgenlik yıkama tamponu ekleyin. Kısaca hücreleri girdaplayın ve hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 100 mikrolitre geçirgenlik yıkama tamponu ekleyin.

Hücreleri pelet haline getirin ve daha önce gösterildiği gibi aynı tamponun 100 mikrolitresinde üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve tek hücreli süspansiyonu beş mililitrelik bir akış sitometri tüpüne aktarın. Geçirgen olmayan ve geçirgen hücreleri aynı gün akış sitometresinden geçirin.

Başlamak için akış sitometrisi analiz yazılımını başlatın ve akış sitometrisi sırasında oluşturulan fcs dosyalarını içe aktarın. İlk örneğe tıklayın ve yan saçılma ve ileri saçılma grafiğinde geçit işlemini başlatın. Ardından, kalıntıları, ölü hücreleri veya agregaları ortadan kaldırmak için canlı hücrelerin etrafındaki elips simgesini kullanarak P1 kapısını çizin.

Ardından, mCherry'nin FITC floresan yoğunluğuna karşı tüp parametresi kontur grafiğini çizin. P2 kapısını FITC ve mCherry pozitif hücrelerin etrafına ve P3 kapısını floresan negatif hücre popülasyonunun etrafına yerleştirin. Ardından, P2 ve P3 kapılarını seçin ve orijinal çalışma alanı penceresindeki istatistik ekle simgesine tıklayın.

Sayıma tıklayın ve ardından ortalamaya tıklayın. Son olarak, gates parametrelerini ve istatistiklerini sitometre tarafından incelenen tüm örneklere uygulayın. Bu protokol, TSA201 hücrelerinde CaV Alfa 2 Delta 1'in toplam ve hücre yüzeyi ekspresyonu üzerindeki N-glikozilasyonun rolünü karakterize etmek için kullanıldı.

Hücre yüzeyine erişmek için protein ekspresyonu HA, dört bölgede, 16 bölgede veya hiç bölgede bozulmuş N-glikosilasyon bölgeleri olan geçirgen olmayan hücreler üzerinde ölçüldü. FITC seviyeleri vahşi tipte güçlüydü ve N-glikozilasyon hücrelerine sahip hücreler dört yerde bozuldu, ancak 16 lokasyonu bozulmuş hücrelerde sadece arka plan seviyeleri bulundu. Geçirgen hücreler için, FITC floresansı tüm koşullar için artmıştır, bu da tüm transfekte, HA etiketli, CaV Alpha 2 Delta 1 proteinlerinin boyandığını ve anti HA FITC antikoru tarafından tespit edildiğini gösterir.

Ek olarak, mCherry floresan seviyeleri, geçirgen ve geçirgen olmayan hücreler için benzerdi, bu da geçirgenliğin bağıl mCherry sinyalini değiştirmediğini gösterir. Hücre geçirgenliğinden sonra yapılan tahliller, 16 lokasyonu bozulmuş hücreler için toplam protein ekspresyonunun da önemli ölçüde azaldığını gösterdi, ister geçirgenleştirilmiş hücrelerdeki FITC floresansından ister geçirgen olmayan ve geçirgen hücrelerde ölçülen kurucu mCherry floresansından çıkarılsın. Bu prosedüre ek olarak, iyon kanallarının ekspresyonunu ve işlevini ilişkilendirmek için ekstra fizyolojik kayıtlar yapılabilir.

Bu teknik aynı zamanda tıp alanındaki araştırmacıların, genetik mutasyonların, posttranslasyonel modifikasyonların, mikroRNA'ların, küçük GTPazların ve rekombinant veya doğal hücrelerde eksprese edilen zar proteinlerinin kaçakçılığında şaperonların rolünü incelemelerinin yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, rekombinant hücrelerde DNA transfeksiyonunun nasıl yapılacağını, NTAC ve geçirgen hücrelerin nasıl boyanacağını ve numuneler üzerinde veri analizinin nasıl yapılacağını iyi anlamalısınız. Canlı hücrelerle çalışmanın, transfiksasyon için helaminal sıvıda çalışmak ve kimyasalları tutarken eldiven giymek gibi önlemler gerektirdiğini unutmayın.