arasında Transkriptomik Analizi C. elegans RNA Sıralama Veri

Bu protokolün genel amacı, biyoinformatik uzmanlığı olmayan C.elegans araştırmacılarının bir RNA dizileme deneyi yapmalarına ve açık erişim platformu Galaxy'yi kullanarak verileri analiz etmelerine yardımcı olmaktır. Bu yöntem, C.elegans'taki fenotiplerin arkasındaki transkriptomik imzalar hakkında içgörüler sağlamak için karmaşık yüksek dizileme verilerini analiz etmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, önceden biyoinformatik eğitimi almamış bilim adamlarının ham dizileme verilerini analiz etmelerini ve ilişkili gen ontolojisi terimleriyle birlikte diferansiyel olarak ifade edilen genlerin bir listesini üretmelerini sağlamasıdır.

Bu yöntem özellikle C.elegans dizileme verilerinin nüanslarına yönelik olsa da, genomların, anahtar transkripsiyon değişikliklerinin incelenmesi gereken diğer organizmalara ve biyolojik bağlama da uygulanabilir. Bu video, Galaxy boru hattının web tabanlı kullanımı ile ilgilidir. Mümkünse, iş akışını yerel olarak çalıştırın.

Wiki sayfasındaki talimatlara göre Galaxy'yi indirin ve kurun. Galaxy ana sayfasında sağlanan buradan başlayın eğitimini kullandıktan sonra bu videoyu izleyin. Kullanıcının Galaxy kullanıcı arayüzünü ve iş akışında kullanılan araçları tanıması ve bunlara yönelmesi çok önemlidir.

Başlamak için, analiz ana sayfa görünümüne erişmek için başlık panelindeki verileri analiz et'e tıklayın. Sağ üstteki ilerleme çubuğu, ne kadar disk alanı kullanıldığını izler. Ardından, sol paneldeki araçlar menüsüne erişin ve NGS RNA analizine tıklayın.

Bu, RNA dizi verilerinin analizi için gerekli tüm araçları kullanma seçenekleri sağlar. Şimdi yeni bir analiz geçmişi başlatın. Sağdaki geçmiş paneline gidin.

Dişli çark simgesine tıklayın ve açılır menüden yeni oluştur seçeneğini seçin. Ardından, analizi tanımlamak için geçmiş altında bir ad girin. Devam etmek için araçlar menüsüne gidin ve veri al altında, ham hızlı kuyruk dosyalarını karşıya yüklemek için dosya yükleme işlevine tıklayın.

Görev analiz arayüzünde açıldıktan sonra, yerel dosyayı seç'e tıklayın veya uygun dizi verilerine gitmek ve seçmek için FTP dosyasını seçin. Varsayılan olarak, Galaxy dosya türünü otomatik olarak algılar. Ardından, açılır menüden bu durumda C.elegans olan organizmayı seçin.

Ardından, veri yüklemeyi başlatmak için başlat'a tıklayın. Dosya yüklendikten sonra eylem, verilerin seçilebileceği ve erişilebileceği geçmiş paneline kaydedilir. Şimdi, NGS QC ve manipülasyon menüsüne erişerek, hızlı kuyruk düzleştiriciyi seçerek, taranacak dosya altındaki dosyayı seçerek dosyaları hızlı kuyruk biçiminden hızlı kuyruk sanger biçimine dönüştürün.

Uygun giriş hızlı eşitlik puanlarını seçin, varsayılan parametreleri kullanarak aracı yazın ve çalıştırın. Veri dosyası artık analiz edilebilir. Protokol boyunca kullanılan dosya formatlarına ve test parametrelerine özellikle dikkat edin.

Bu bilgi, başarısız testleri ve diğer sorunları gidermek için değerlidir. Devam etmeden önce kalite kontrol testleri kullanılabilir. Bunları çalıştırmayla ilgili ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir.

Bir dosya analiz etmeye hazır olduğunda, önce NGS RNA analizi bölümünü açarak ve ardından üst şapka aracına tıklayarak sıralama verilerini eşleyin. Açılır menüden, bu tek mi yoksa eşleştirilmiş son veri mi sorusunun cevabını doldurun. Ardından, uygun hızlı kuyruk dosyasını seçin.

Sonraki açılır menüde yerleşik bir genom kullan'ı seçin ve referans C.elegans genom verilerini seçin. Diğer tüm parametre seçenekleri için varsayılanı seçin ve ardından yürüt'e tıklayın. Veri setindeki transkriptlerin nispi bolluğunu tahmin etmek için, NGS RNA analizi bölümündeki kol düğmeleri aracını seçin ve ilk açılır menüden, üst şapka analizinden elde edilen eşlenmiş kabul edilen isabetleri bam formatındaki dosyayı seçin.

İkinci açılır menüden, referans ek açıklamasını mevcut genom verilerini içeren GTF dosyasına ayarlayın. Sapma düzeltmesi gerçekleştir seçeneği sunulduğunda evet'i seçin ve varsayılan ayarları kullanarak görevi çalıştırın. Ardından, tüm RNA dizisi örnekleri için üretilen birleştirilmiş transkriptleri birleştirmek için NGS RNA analizi menüsünden manşet birleştirme aracını açın.

Araçtaki ilk kutu, önceki adımda kol düğmeleri kullanılarak üretilen tüm GTF dosyalarını yükler. Şimdi, aynı gerinim koşulunun biyolojik kopyaları da dahil olmak üzere test edilen suşların veya koşulların her biri için birleştirilmiş transkript dosyasını seçin. Kullanıcı başvurusu ek açıklaması için evet'i seçin ve başvuru genom veri dosyasını seçin.

Ardından, sıra verilerini kullan seçeneği için evet'i seçin. Bu, uygun referans genomu otomatik olarak algılar ve seçer. Diğer tüm parametreleri varsayılan ayarlarında bırakın ve yürüt'e tıklayın.

Tek bir GTF dosyası üretilecektir. Birden fazla suşu veya koşulu karşılaştırmak için NGS RNA analizi bölümüne geri dönün ve manşet div aracını seçin. Ardından, manşet div aracındaki transkriptler menüsünden, manşet birleştirmeden birleştirilmiş çıktı dosyasını seçin.

Ardından, iki koşul için etiketleri girin. Her koşul için çoğaltmalara gidin ve üst şapkadan o koşulun farklı biyolojik kopyalarına karşılık gelen kabul edilen isabet çıktı dosyalarını seçin. Aynı anda birden fazla dosya seçmek için komut veya kontrol tuşunu basılı tutun.

Dosyaları seçtikten sonra, varsayılan parametre ayarlarını kullanın ve görevi çalıştırmak için yürüt'e tıklayın. Geçmiş panelinde oluşturulan gen diferansiyel test kutusundaki kaydet simgesine tıklayarak diferansiyel olarak ifade edilen verileri indirin. Başlamak için web sitesinden David'e erişin.

Web sayfasının üst bilgisinden Analizi başlat'ı seçin. Galaxy'den elde edilen genlerin listesini A kutusuna kopyalayın ve bu örnekte solucan tabanı gen kimliği olarak gen tanımlayıcısını seçin.Ardından üçüncü sorudaki liste türü altında gen listesini seçin ve listeyi gönder simgesine tıklayın. Şimdi, David görevlerinin seçilebileceği analiz sihirbazı ana sayfası açılacaktır.

Bu video segmentinde bu seçeneklerden birkaçı açıklanmaktadır. İlk olarak, özet sayfasına gitmek için işlevsel açıklama kümelemesini seçin. Ek açıklama kategorilerini varsayılan ayarlarında bırakın ve işlevsel açıklama kümelemesi'ne tıklayın.

Bu seçenek, zenginleştirme puanlarına göre sıralanmış benzer ek açıklama terimlerinden oluşan kümeler oluşturur. Şimdi, analiz sihirbazına dönün ve gen listesiyle ilişkili önemli ölçüde fazla temsil edilen biyolojik terimleri tanımlamak için işlevsel açıklama tablosu seçeneğini seçin. Değerli bir David özelliği, işlevsel bir açıklama tablosu oluşturma seçeneğidir.

Bu, herhangi bir istatistiksel hesaplama göstermeden genlerle ilişkili tüm ek açıklamaları listeler. Bu, gen analizi ile gen için ve ilgilenilen belirli genleri bulmak için yararlı olabilir. Gözden geçirilmesi gereken bir başka yararlı David aracı, gen fonksiyonel sınıflandırmasıdır.

Bu seçenek, genleri, zenginleştirme puanlarına göre sıralanmış işlevsel olarak ilişkili grupların bir listesine ayırır. Açıklanan protokol, germ hattı kaybını takiben ekspresyonu tcer-1 tarafından modüle edilen genleri tanımlamak için kullanıldı. Uzun ömürlü germ hattı listesi glp-1 mutantlarının transkriptomu, germ hattımızın listelediği ancak yaşam süresi uzaması göstermeyen tcer-1 glp-1 çift mutantları ile karşılaştırıldı.

Dizilerin kalite kontrolü, düşük kaliteli okumalar, %48 ila %49 GC içeriği ve 51 baz çiftinin sabit dizi okuma uzunluğu bulamadı. Örneklerin genom kapsamının yedi kat ile 11 kat arasında olduğu tahmin ediliyordu. Galaxy, her bir suşun iki kopyasından elde edilen NGS verilerinin kombinasyonunu sağladı ve genom geniş ekspresyon profilini vurgulayan gen listeleri oluşturmak için diferansiyel analiz gerçekleştirdi.

Genel olarak, 835 gen, 0.05'lik bir P değeri kesimi kullanılarak iki suş arasında farklı şekilde ifade edildi. Yukarı regüle edilmiş genlerin fonksiyonel notasyon analizi, yüksek zenginleştirme skorlarına sahip dört anotasyon kümesini ortaya çıkardı. Sitokrom P450 ve ksenobiyotik yanıt genleri dahil olmak üzere en yüksek olanı, ardından lipid modifikasyonlarında rol oynayan genler gelir.

Aşağı düzenlenmiş hedeflerin işlevsel açıklama kümelemesi ayrıca çeşitli açıklama kümelerini de tanımladı. Bunlar, hücre iskeleti fonksiyonu, büyümenin pozitif düzenlenmesi, üreme ve yaşlanma için zenginleştirilmiş kümeleri içeriyordu. Galaxy boru hattı, çok çeşitli biyolojik disiplinlerdeki araştırmacıların, büyük ölçekli gen ekspresyonu değişikliklerini hızlı ve verimli bir şekilde analiz etmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, bir RNA arama deneyi yapabilmeli ve Galaxy boru hattını kullanarak ham yüksek dizileme verilerini analiz edebilmelisiniz. Ayrıca, David platformunu kullanarak Galaxy verilerinden biyolojik olarak ilgili bilgileri çıkarabilmelisiniz.