Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

Bu prosedürün genel amacı, elektroporasyonlu civciv embriyonik omuriliklerinden alınan tüm genlerin ve örneklerin ekspresyon seviyelerini değerlendirmektir. Bu, ilk olarak ovo'da, erken embriyonik nöral tüplerin sağ tarafının gözeneklenmesi ve embriyoların istenen aşamaya kadar yeniden inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, başarılı bir şekilde transfekte edilmiş nöral tüp yarımlarını RNA içermeyen bir ortamda diseke etmek ve mümkün olan en kısa sürede lizise devam etmektir.

Üçüncü adım, RNA'yı izole etmek ve numuneleri kütüphane hazırlığına ve yüksek verimli dizilemeye tabi tutmaktır. Son adım, sıralama yapılarını kaldırmak için veri kümelerini işlemektir. Irkları genomla eşleştirin ve her gene ekspresyon seviyeleri atayın.

Sonuç olarak, sonuçlar, kontrol ve deneysel koşullarda ekspresyon seviyelerinin karşılaştırılması yoluyla diferansiyel olarak ifade edilen genleri gösterebilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, nörotüp diseksiyonu için kritik öneme sahiptir. Adımları öğrenmek zordur çünkü embriyo manipülasyonuna aşinalık gerektirir.

Bu gösteri için, embriyolar nöral tüpte GFP eksprese edici yapı ile dönüştürülmüştür. Embriyo başına bir ila iki mikrogram toplam RNA toplamak için 10 embriyoya kadar iki saat çalışmaya hazırlanın. RNA'lar altında, serbest koşullarda, ince diseksiyon makası kullanarak embriyoları toplayın ve bir SVE toplama kaşığı kullanarak her embriyoyu soğuğa aktarın.

DEPC tedavi edildi. PBS, tüm nöral tüp izolasyon adımları için bir çözüm kullandı, bir embriyonun uzuv tomurcukları arasındaki tüm yan bölgesini çıkarmak için ince cımbız kullanarak ilerleyin. Bu bölümü, doku dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde taze soğuk solüsyona taşıyın.

Embriyonun her bir dorsal lateral tarafında nöral tüp ile parial mezoderm arasındaki üç noktayı delmek için iki ince cam iğne kullanın. Şimdi iki cam iğneyi merkezi perforasyona sokun ve AP ekseni boyunca birbirinden ayırın. Bunu, paral mezodermi nihayetinde ayırmak, bu dokuyu çıkarmak ve atmak için gerektiği gibi her delikten yapın.

Daha sonra, embriyoyu yana doğru çevirin ve nöral tüp ile düğüm kordonu arasına iki cımbız ucunu yerleştirin. Yapıları bölmek için bunları AP ekseni boyunca kaydırın. Fazla mezodermi cımbızlarken cımbızla nazikçe sabitleyerek nöral tüpten daha büyük meder dokusu parçalarını çıkarmayı bitirin.

Ardından nöral tüpü nazikçe taze soğuk solüsyona aktarın. Manuel pompalı bir cam pipet kullanarak, gerekli tüm nöral tüpleri toplayın ve devam etmeden önce buz üzerinde tutun. Şimdi, nöral tüplerin her birini iki yarıya bölün.

Keskin uçlu cımbızları lümene sokun ve tavan plakasını yırtın. Daha sonra zemin plakasını kesmek ve dokuyu ikiye bölmek için cımbız kullanın. Bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak, elektroporasyonlu olanları elektroporasyonlu olmayan yarımlardan ayırın.

Sıralanan nöral tüp yarımlarını taze çözelti ile 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüm dokuyu dibe indirmek için bu tüpleri hafifçe vurun. Ardından, tüpleri birkaç saniye boyunca 100 GS'de döndürün.

Sonra parlak aydınlatma altında çok dikkatli bir şekilde, kepçeyi aspire edin. Doku çekilirse, yavaşça çıkarın ve dönüşü tekrarlayın. Nöral tüp yarımları çözeltiden arındırıldıktan sonra, nöral tüp başına 70 mikrolitre, lizis tamponunun yarısını tüpe ekleyin.

Tüpü hafifçe vurun ve her beş dakikada bir 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin, tüpü kuvvetlice girdaplayın ve RNA'yı saflaştırmak için RNA'yı toplamaya devam edin Sıralama için, numune başına en az sekiz nöral tüp yarısına sahip olun. Negatif 80 santigrat derecede saklanan diğer lise nöral tüp koleksiyonları koleksiyona dahil edilebilir. 15 ila 30 dakika buz üzerinde çözdürerek başlayın ve ardından çözdürme işlemini oda sıcaklığında tamamlayın.

Çözüldükten sonra, tüm numuneleri kuvvetlice girdaplayın ve beş dakika bekletin. Daha sonra numuneleri tekrar vorteksleyin ve bir dakika boyunca 15.000 GS'de santrifüjleyin. Çözünmeyen malzemeden kurtulmak için, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve ekstraksiyona devam edin.

Bir RNA izolasyon kiti kullanarak, RNA'yı mümkün olan en yüksek konsantrasyonda atlatarak işlemi tamamlayın. Bu protokol, gerekli alan kotasını sağlamak için bir Galaxy web sitesi hesabı gerektirir. İlk olarak, kalite puanları zaten Shred artı 33'te kodlanmamışsa, FTP FASTQ dosyalarını siteye yükleyin.

İlk olarak, NGS QC ve Manipülasyon menüsü altındaki FASTQ bakım aracını kullanarak yüklenen veri setlerini hazırlayın. Aksi takdirde, öznitelikler altında dosya türünü FASTQ sender olarak değiştirin. Ardından, NGS QC ve Manipülasyon menüsü altında, veri setlerinin genel kalitesini analiz etmek için FAST QC aracını kullanın.

Düşük kalitedeki üç ana ucu atmak için aynı menü altında FASTQ kalite düzelticiyi seçin. 20 veya üzeri bir kalite puanı işlenmelidir. Şimdi aynı menü altındaki klip aracına gidin.

Bu aracı, 45'ten az baz çifti içeren okumaları atacak şekilde ayarlayın. Adaptör sırasını girin. Bilinmeyen tabanlara sahip okumaları atma seçeneğini devre dışı bırakın ve kırpılmış ve kırpılmamış dizileri dahil etmek için çıktıyı seçin.

Kırpma dizileri aracıyla devam edin. FAST qc tarafından algılanan beş asal dizi yanlılığını gidermek için okumanın ilk tabanlarını kırpmak için kullanın. Bir sonraki adım, Illumina I genom sitesinden en son tavuk genom düzeneğini indirmek ve paketinden çıkarmaktır.

Ardından, tüm genom daha hızlı format dosyasını ve genin açıklama GTF format dosyasını Galaxy History'ye yükleyin. Şimdi, N-G-S-R-N-A analiz menüsüne erişerek ve üst şapka iki aracını seçerek her örnek için okumaları genomla eşleştirin. Referans genom olarak Galaxy Geçmişinden yüklenen fasta dosyasını seçin.

Ardından, tahmini bir transkriptom oluşturmak için aynı menü altındaki kol düğmeleri aracını seçin. Her örnek için, referans açıklama kılavuzu olarak kullanılacak GTF dosyasını seçin. Dizi verileri için FASTA dosyasını kullanarak sapma düzeltmesi gerçekleştir'i seçin ve çoklu okuma düzeltmesini kullan seçeneğini etkinleştirin.

Ardından, manşet birleştirme aracını kullanarak tüm birleştirme transkriptomlarını birleştirin. Bu araçla, referans ek açıklaması için GTF dosyasını ve dizi verileri için FASTA dosyasını seçin. Şimdi, hala RNA analizi menüsü altında bulunan manşet TIFF aracını kullanarak her örnek için üst şapka iki tarafından oluşturulan BAM dosyalarını karşılaştırın.

Transkriptler alanında, manşet birleştirme tarafından oluşturulan birleştirme transkriptomunu seçin ve seçenekleri etkinleştirin. Çoklu okuma düzeltmesini kullanın ve dizi verileri için FASTA dosyasını kullanarak sapma düzeltmesi gerçekleştirin. Bir sonraki adım, diferansiyel tabloları sıralamaktır Q değeri sütununu kullanarak, filtre ve sıralama menüsünden sıralama aracını seçin.

Deney koşulları arasında önemli fark olan diziler, sütun 13'te en düşük Q değerlerine sahip olacaktır. Şimdi kapsama grafiklerine bir göz atın. İlk olarak, seçeneklerin altındaki yatak araçları menüsü altındaki dönüştürme aracını kullanarak BAM dosyalarını yatak grafiği dosyalarına dönüştürün, kapsama alanı olmayan bölgelerin raporlanmasını devre dışı bırakın ve eklenmiş girişleri ayrı aralıklar olarak ele almayı seçin.

Ayrıca kapsamı, deneydeki tüm kapsamları normalleştiren bir faktöre göre ölçeklendirin. Ardından, dönüştürme biçimleri menüsündeki aracı kullanarak ortaya çıkan yatak grafiği dosyasını büyük peruk formatına dönüştürün ve büyük peruk dosyasını özel bir parça olarak UCSE sunucusuna yükleyin. USCS genom tarayıcı sayfasında, RNA'ları için boş PS vektörlerini ifade eden nöral tüplerin açıklanan yöntemleri kullanarak veri setlerinin görsel kapsamı için GAL dört derlemesini ve gen aramalarını kullanın.

Bu çift olarak yapıldı ve elde edilen RNA, beklendiği gibi 10'luk bir optimal RIN değeri ile çok yüksek bir kalitedeydi. Çoğaltılmış boş vektör kontrollerinin transkriptomlarının küresel karşılaştırması net bir fark göstermedi ve Pearson korelasyon katsayısı 99 idi. Ayrıca, çizik iki çinko parmak alanını ifade eden deneysel bir örnekte çizik iki gen dizisine eşlenen okuma sayısında belirgin bir artış oldu.

Bu nedenle, yöntemler tahmin edilen zenginleşmeyi tespit edecek kadar hassastı. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik nöro tüpü izole edebilmeli ve protokolün dördüncü bölümündeki silikon analiz adımlarını izleyerek diferansiyel olarak ifade edilen genleri bulmak için IC veri setinin nasıl işleneceğini ve karşılaştırılacağını iyi bir şekilde anlamalısınız.