Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Bu prosedürün genel amacı, birden fazla potansiyel fosforilasyon bölgesini aynı anda değerlendirmek ve fosforilasyon bölgesi mutantları tarafından müteakip doğrulama için bölgeleri belirlemektir. Bu yöntem, biyokimya ve hücre biyolojisi alanlarında, hücre sinyalizasyonunda translasyon sonrası modifikasyonların rolü hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, fosforilasyon bölgeleri ve ilgilenilen protein için kolay, bütçe dostu ön tarama sağlar.

Bu tekniğin anlamı, iltihaplanma ve kanser dahil olmak üzere hastalıkların tanı ve tedavisine doğru genişledi, çünkü fosforilasyon, insan hastalıklarındaki sinyal yollarında önemli bir biyokimyasal olaydır. Gösteriye yardım etmek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan ve sahada mutajenez yönetirken Sol-Bi Shin olacaktı. İlk önce 50 nanogram plazma pGEX JST NRF2, 125 nanogram ileri astar, 125 nanogram ters astar, bir mikrolitre DNTP karışımı 2.5 birim PFU DNA polimeraz ve 10x reaksiyon tamponunu buz üzerinde birleştirin.

Hacmi 50 mikrolitreye çıkarmak için steril damıtılmış su ekleyin. Mutant ipliği dahil etmek için PCR gerçekleştirin ve ardından numuneyi iki dakika buz üzerinde soğutun. Soğutulmuş numuneye bir mikrolitre DPNI kısıtlama enzimi ekleyin.

Numuneyi nazik pipetleme ile karıştırın ve ardından numuneyi 13.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Ebeveyn çift sarmallı DNA'yı sindirmek için numuneyi 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Daha sonra endA1 ve RACA1 mutasyonlarına sahip süper yetkin E.coli hücrelerini buz üzerine atın. Soğutulmuş hücrelere 50 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Bu arada, bir ısıtma bloğunu 42 santigrat dereceye ısıtın. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, karışımı 42 santigrat derecede 90 saniye ısıtın ve ardından karışımı buz üzerinde iki dakika soğutun. Dönüştürülmüş hücrelere önceden ısıtılmış Lizojen suyu ekleyin.

Karışımı 180 RPM'de çalkalarken 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra hücreleri LB ampisilin agar plakalarına yayın ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tek bir koloniyi ampisilin ile beş mililitre Lizojen suyuna aktarın.

Numuneleri 37 RPM'de çalkalarken 180 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. DNA dizi analizi için standart bir mini hazırlık kiti kullanarak örnek DNA'yı çıkarın. Mutant diziyi doğrulamak için bir DNA analizöründe en az 200 nanogram HDNA yapısı çalıştırın.

Doğrulanmış mutant NRF2 proteinini eksprese edin ve saflaştırın. Kinaz testine devam etmeden önce üretilen mutasyona uğramış NRF2 miktarını belirleyin. Peptit rekabet testine başlamak için, 500 mikromolar adenosin monofosfat konsantrasyonuna sahip bir 5X kinaz tampon çözeltisi hazırlayın.

Daha sonra, AMPK vahşi tip insan NRF2'nin donmuş örneklerini ve NRF2'nin AMPK fosforilasyon bölgelerini taklit eden üç oliogopeptidi çözün. Her peptit için, buz üzerindeyken, 0.43 miligram peptiti 0.15 mikrogram AMPK, 0.4 mikrogram NRF2 ve altı mikrolitre 5X Kinaz Tamponu ile birleştirin. 30 mikrolitrelik bir son hacim elde etmek için steril damıtılmış su ekleyin.

Ardından korumalı bir alanda, bir ısıtma bloğunu 30 santigrat dereceye ayarlayın. Her tüpe bir mikroküri gamma 32P ATP ekleyin, her bir çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Reaksiyon karışımlarını 30 santigrat derecede 15 ila 30 dakika inkübe edin.

Kuluçka sırasında,% 7.5 STS PAGE jeli hazırlayın. Daha sonra her tüpe üç mikrolitre 10X STS numune tamponu ekleyin ve kinaz reaksiyonunu durdurmak için iyice karıştırın. Numuneleri jel içinde 70 voltta 20 dakika ve ardından bir saat boyunca 140 voltta çalıştırın.

Jel elektroforezini tamamladıktan sonra, bromofenol mavi çizgisinin altındaki yüksek radyoaktif jeli dikkatlice çıkarın. Jeli tekerden yavaşça bir cam tüpe aktarın. Jeli 20 dakika boyunca %50 metanol, %40 su ve %10 asetik asit çözeltisine sabitleyin.

Ardından jeli nazikçe filtre kağıdına yerleştirin ve şeffaf bir sargı ile örtün. Jeli vakumlu jel kurutucu ile 80 santigrat derecede bir saat kurutun. Kuru jeli sırasıyla iki gün boyunca yaklaşık 16 saat boyunca bir fosfor ekranına veya bir röntgen filmine maruz bırakın.

Ekranın yüksek çözünürlüklü bir TIFF veya Bitmap dosyasını oluşturmak için bir Fosfor Görüntüleyici kullanın. AMPK aktivite testine başlamak için, AMPK ve mutant ve vahşi tip GST NRF2 örneklerini buz üzerinde çözdürün. 0.4 mikrogram mutant GST NRF2'yi 0.15 mikrogram AMPK ve altı mikrolitre 5X Kinaz tamponu ile birleştirin.

Hacmi 30 mikrolitreye çıkarmak için steril damıtılmış su ekleyin. Bu şekilde 0.4 mikrogram vahşi tip GST NRF2 ile başka bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Her reaksiyon şişesine bir mikroküri gama 32P ATP ekleyin.

Karışımları birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından karışımları kısaca santrifüjleyin. Karışımları 30 santigrat derecede korumalı bir alanda 30 dakika inkübe edin ve ardından kinaz reaksiyonunu üç mikrolitre 10X STS numune tamponu ile sonlandırın. STS PAGE'i çalıştırın, jeli sabitleyin ve rekabetçi kinaz testi ile aynı koşulları kullanarak jeli kurutun.

Jeli gece boyunca bir fosfor ekranına maruz bırakın ve ekranı Fosfor Görüntüleyici ile tarayın. İnsan NRF2 üzerindeki AMPK fosforilasyon bölgelerini taklit eden üç adet 10 kalıntı oligopeptidin varlığında bir in vitro AMPK testi gerçekleştirildi. Serine 558 bölgesini taklit eden oligopeptid, AMPK fosforilasyonu için en büyük rekabeti sundu.

Serin 558'i alanin ile değiştiren bir NRF2 mutantı daha sonra sentezlendi ve bir in vitro aktivite testinde değerlendirildi. S558 A mutantının çok az AMPK fosforilasyonu gözlendi, bu da AMPK'nin Serin 558'de insan NRF2'sini doğrudan fosforile ettiğini gösteriyor. Peptitler proteinlere rekabetçi bir şekilde bağlandığından, bu yöntemin prensibi, asetilizasyon ve lizin kalıntıları ve protein protein etkileşimleri gibi diğer translasyon sonrası ve modifikasyonların tanımlanması için de uygulanabilir.

Radyo izotopuyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce radyo izotop güvenliği eğitimi alınmalıdır.