İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Bu prosedürün genel amacı, proteomik analizler için uygun olan proteinleri insan kalp mitral kapağından etkili bir şekilde ekstrakte etmektir. Bu yöntem, kalp kapak hastalığı alanındaki patojenik mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir ve yeni tanısal ve prognostik hastalık belirteçlerinin, ayrıca umulur ki terapötik hedeflerin belirlenmesine olanak tanır. Bu protokolün temel avantajı, birçok analitik uygulama ile uyumlu, etkili bir ekstraksiyon iş akışı sağlamasıdır.

Sonuçlar, kalp mitral kapak proteomunun daha kapsamlı bir karakterizasyonunu sunmaktadır. Ayrıca bu protokol, insan kapağına çok benzeyen ve kapak fonksiyon değerlendirmeleri için deneysel modellerde kullanılan porcine mitral kapak gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Deneysel prosedürü, laboratuvarımdan teknisyen Stefania Ghilardi uygulamalı olarak gösterecektir.

İnsan mitral kapakçığını hazırlamak için, dört ila 12 saat boyunca soğuk iskemiye maruz kalmış, eksize edilmiş bir kalp ile başlayın. Temiz oda içerisinde kalbi taşıma torbasından çıkarıp sterilize edilmiş bir kovaya yerleştirin. Ardından, kalbi bir biyosafety kabine aktarın.

Burada, tek kullanımlık bir bistüri kullanarak, apeksin yaklaşık dört santimetre uzağında, sol ve sağ ventriküller seviyesinde majör aksa dik olacak şekilde kesin. Ardından kalbi steril bir örtünün üzerine yerleştirin. Sonra, sol atriyum tavanına erişmek için asendan aortayı ve pulmoner arteri yana çekin.

Sol atriyum tavanında, mitral kapakçığı açığa çıkarmak için forseps ve pens kullanarak sol aurikül çevresini kesin. Mitral kapak tamamen sol ventrikülün içindedir. Bu nedenle, büyük mitral yaprakçığı ve küçük mitral yaprakçığı açığa çıkarın.

Anterolateral ve posteromedial komissürler, anterior ve posterior alanların sınırlarını belirler. Şimdi, makas ve travmatik olmayan pensler yardımıyla sol atriumu ve mitral kapak çevresindeki ventrikül duvar kalınlığını diseke edin. Bu diseksiyon sırasında, mitral aort kapak sürekliliğini belirleyin.

Ardından, posterior yaprağı çevreleyen komissürler boyunca kesim yaparak anterior mitral kapak yaprağını posterior mitral kapak yaprağından ayırın. İşlem tamamlandığında, kabin tablasını %70 izopropil alkol çözeltisi ve %6 hidrojen peroksit çözeltisi ile sterilize edin. Şimdi, mitral kapağın posterior yaprağını salin ile yıkayın.

Ardından, kapağı her biri bir santimetrekareden küçük olacak şekilde küçük parçalara ayırın. Parçaları tek tek alüminyum folyoya sarın ve sıvı azot ile şok dondurun. Protein ekstraksiyonuna başlamak için bir pens yardımıyla sıvı azottan bir örnek çıkarın ve örneği derhal kuru buz üzerine yerleştirin.

Numunenin çözülmesine izin vermeyin. Ardından, sıvı azotla doldurulmuş bir dewar şişesinin içine havanda, ilgili havan tokmağıyla birlikte numuneyi yerleştirin. Sıvı azotun, numuneyi dondurmak ve öğütücü sistemi soğutmak için kullanılması kritik öneme sahiptir.

Bu adım biyolojik bozunmayı önler ve etkili şekilde toz haline getirmeye olanak tanır, ancak güvenli uygulama için teknik eğitim gerektirir. Şok dondurma işlemi tamamlandıktan sonra, havana ve havan tokmaklarını kuru buz içeren bir polistiren kutuya yerleştirin. Ayrıca, bir spatülü de kuru buzun üzerine koyun.

Ardından, örneği folyodan çıkarın ve havana yerleştirin. Daha büyük olan eli havanın üzerine konumlandırın. Bir tornavida kullanarak eli döndürün ve örneği 15 ila 20 kez öğütün.

Öğütme işlemi sırasında, örneği soğutulmuş bir spatül ucuyla karıştırın. Büyük havan eliyle işlem tamamlandıktan sonra, öğütme işlemini daha küçük bir havan eliyle tekrarlayın. Protein ekstraksiyonunun verimli olması için ince bir toz elde edilmesi kritiktir.

Şimdi, toz halindeki numuneyi kütlesi bilinen 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, havan içerisinde kalan materyalleri soğuk bir spatula yardımıyla tüpe itin. Numunenin bulunduğu tüpü kuru buz üzerinde tutun ve numunenin kütlesini hızlıca belirleyin.

Ardından, örneği cam bir homogenizatör tüpüne aktarın. Daha sonra, her 10 mg örnek için 200 µL üre tamponu ekleyin. Bunu yaparken, tüpte kalan kalıntıları üre tamponu alikotu ile durulayarak geri kazanın.

Şimdi, 1.500 rpm hızında çalışan motorlu bir PTFE havan eli kullanarak örneği homojenize edin. Havan elini, bükme hareketi yaparak yavaşça örneğin üzerine 10 kez bastırın. Ardından, viskoz sarı süpernatantı bir cam pipet yardımıyla temiz bir 1,7 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.

Şimdi, kalan numunede yarı miktarda üre kullanarak homojenizasyonu tekrarlayın. Süpernatantı geri kazanarak önceki toplama ile birleştirin. Ardından, tüpü 30 dakika boyunca bir tüp rotatörüne yerleştirin.

30 dakika sonra, tüpü soğuk bir santrifüje yerleştirin ve örneği 13.000 G'de yarım saat boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı geri kazanım yoluyla toplayın. Ve Bradford protein analizi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.

Öngörülen protokol uygulandıktan sonra, protein ekstraktı bazı ek işlemlerin ardından çeşitli yöntemler kullanılarak incelenmiştir. Mitral kapak dokusunda iki boyutlu elektroforez, sıvı faz izoelektrik odaklama, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ve 2D sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile toplam 422 protein tanımlanmıştır. Bu 422 protein, Gen Ontolojisi analizi kullanılarak sınıflandırılmıştır.

Hücre dışı bölgeler, beklenen birkaç proteinin yanı sıra diğer hücre içi ve hücre yüzeyi proteinlerini de içermekteydi. Bunların çoğu mitral kapaklarda ilk kez tanımlanan proteinlerdi. Daha önce mitral kapaklarda tespit edilmemiş dört proteinin varlığı, üç farklı örnekte antikorlarla doğrulanmıştır.

Proteinler Septin-11, Four and a half LIM domains protein one, Dermatoponin ve alpha crystalline B'dir. Bu videoyu izledikten sonra, tanımlama ve miktar belirleme amacıyla kardiyak mitral kapaktan proteinlerin nasılle ekstraksiyon edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu protokol uygun şekilde uygulandığında yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Yüksek protein bütünlüğüne sahip en yüksek protein verimini elde etmek için, bu prosedür uygulanırken örneklerin transfer aşamalarının hiçbirinde çözünmemesi hayati önem taşır.