Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

Bu metodolojinin genel amacı, hücresel tepkileri incelemek için kullanılacak hareketsizleştirilmiş biyoaktif uzamsal protein modelleri oluşturmaktır. Bu yöntem, biyomateryal stratejileri kullanılarak in-vivo sinyallerin özetlenmesine izin verir. Bu teknik, sıralı büyüme faktörleri, hücre hücreleri sinyalizasyonu ve uzamsal spesifik biyokimyasal ipuçları gibi standart kültürleme yöntemleri kullanılarak elde edilemeyen belirli sinyalleme motiflerinin doğru bir şekilde taklit edilmesine izin verir.

Bu protokol, substrat sertliğini ve protein desenini ayarlamak için basit bir yöntem sağladığı için mevcut yöntemler için önemlidir. Bu yöntem doku mühendisliği ve rejeneratif tıp teknolojilerini ilerletebilirken, doku gelişimi ve kök hücre kaderi gibi diğer sistemleri incelemek için de uygulanabilir. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi steril koşullar altında ana hidrojel bileşeni, polietilen glikol diakrilat, foto başlatıcı, lityum fenil-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosfinat ve ECM proteini, fibronektin için stok çözeltileri hazırlayın.

Filtre, tek tek alikotları kullanmadan veya saklamadan önce her bir çözeltiyi 0.22 mikronluk bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin. Ardından, ışıktan korumak için PEG-DA solüsyonunu folyo ile sarın. Fotoğraf başlatıcı stok çözeltisini ışıktan korumak için folyoya sarın ve hazırlanan çözeltiyi birkaç aya kadar dört santigrat derecede saklayın.

Fibronektin stok çözeltisi donmuşsa, steril alikotun birkaç saat veya gece boyunca dört santigrat derecede buz üzerinde çözülmesine izin verin. Her jel kalıp için bir polyester levhayı otoklavlayarak başlayın. Ardından, her bir jel kalıp için üç plastik ara parçada iki cam slaytı en az iki saat boyunca %70 etanol içinde

Ek olarak, her jel kalıp için beş bağlayıcı klipsi 10 dakika boyunca %70 etanol içinde bekletin. Cam slaytları, ara parçaları ve bağlayıcı klipsleri, birkaç saat havada kurumaya bırakmak için hücre kültürü davlumbazındaki küçük bir otoklav tabakasına yerleştirin. Ardından, 0,5 milimetre kalınlığındaki plastik ara parçaları bir cam sürgünün kenarına yerleştirerek hidrojel kalıplarını hazırlayın.

İkinci cam sürgüyü üstüne yerleştirin ve ardından ara parçaları bağlayıcı klipslerle sıkıca yan yana sabitleyin. Son olarak, kalıbı davlumbazın içine yerleştirerek ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca UV ışığını açarak yüzeyi sterilize edin. Sterilizasyon işleminin yarısında, her iki yüzeyi de açığa çıkarmak için kalıbı daha uygun olacak şekilde çevirin.

Eşlik eden metin protokolünün birinci tablosunda açıklandığı gibi jel öncü çözeltilerini oluşturun. Ardından, hidrojeli oluşturmak için PEG-DA, fibronektin ve foto başlatıcı hacimlerini karıştırın. Homojen bir çözelti sağlamak için çözeltiyi kuvvetlice pipetleyin, ancak kabarcık oluşturmaktan kaçının.

Jel öncü solüsyonunu jel kalıbının iki cam slaytı arasına dikkatlice pipetleyin. Ardından, kalıbı bir Uv ışığının altına yerleştirin ve hidrojeli oluşturmak için bir ila iki dakika maruz bırakın. Jelleştikten sonra, bağlayıcı klipsleri çıkarın ve iki yan ara parçaya zıt basınç uygulayarak üst cam sürgüyü nazikçe çıkarın.

Ardından, hidrojel örneklerini kesmek için uygun boyutta biyopsi zımbası kullanın. Replikat ve kontrol numuneleri olarak hizmet etmek için jel dikdörtgeninden birden fazla hidrojel delin. Fotoğraf maskesini 10 dakika boyunca %70 etanole batırarak sterilize edin.

Ardından, fotoğraf maskesinin bir hücre kültürü başlığında kurumasına izin verin. Daha sonra, yüzey desenlemesi için her kesilmiş hidrojelin yüzeyine tiyollenmiş bir protein çözeltisinin santimetre karesi başına bir ila iki mikrolitre pipetleyin. Homojen protein immobilizasyonunu sağlamak için protein çözeltisini hidrojelin yüzeyine eşit şekilde yaymak önemlidir.

Fotoğraf maskesini hidrojelin yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Maske ile hidrojel yüzeyi arasında oluşan kabarcıkları gidermek için maskeye hafifçe bastırın. Ardından, hidrojeli UV ışığının altına yerleştirin ve 30 ila 60 saniye boyunca ikinci bir UV ışığına maruz bırakın.

Reaksiyona girmemiş türleri uzaklaştırmak için hidrojelleri PBS ile yıkayın ve her bir hidrojeli, desen yüzeyi yukarı bakacak şekilde kuyu plakasına yerleştirin. Ardından, jelleri gece boyunca PBS'de dört santigrat derecede yıkayın. PBS'yi kuyulardan çıkarın, ardından her bir oyuğa 250 mikrolitre bazal EGM2 ekleyin ve jelleri 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, tripsin, standart teknikler kullanarak tek hücreli bir süspansiyona yakın birleşen HUVEC'lerden oluşan bir plakayı sindirir. Ardından, hücre süspansiyonunu aşağı doğru döndürün ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücre peletini ve bazal EGM2'yi ilave büyüme faktörü olmadan yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunun bir kısmını bir hemositometreye ekleyin.

Konsantrasyonu belirlemek için hücreleri sayın. Daha sonra, hidrojellerin kuyunun dibinde bulunduğundan ve yüzmediğinden emin olmak için hidrojelleri içeren plakayı 300 x G'de üç dakika boyunca döndürün. Hidrojellerin kuyuların içinde yüzmemesi çok önemlidir.

Yüzen hidrojeller, hücre tohumlamada başarıyı sınırlayacak ve hidrojel görüntüleme ile ilgili sorunlara neden olacaktır. Jelleri rahatsız etmemek için her bir hidrojel yüzeyinin merkezine santimetre kare başına 75.000 hücreyi yavaşça pipetleyin. Ardından, plakayı 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Birkaç gün boyunca, protein paternine yanıt olarak hücre göçünü gözlemlemek için tabağı periyodik olarak çıkarın. Medyanın %50'sini her iki ila üç günde bir değiştirin. Hidrojelleri oluştururken, istenen substrat sertliğini elde etmek için çeşitli öncü PEG-diakrilat konsantrasyonları kullanılabilir.

Burada gösterilen, %20 PEG-DA çözeltisi, 100 kilopaskalın üzerindeki sertlik ile ilişkilidir. Hem foto başlatıcı konsantrasyonunu hem de UV'ye maruz kalma süresini dikkate almak da önemlidir, çünkü her iki değişkendeki bir artış, burada lizozomun biyoaktivitesi ile temsil edilen bağlı moleküllerin biyoaktivitesini azaltacaktır. Hidrojel oluşumu sırasında UV maruziyetinin en aza indirilmesi, sonraki protein immobilizasyon reaksiyonları için serbest akrilat fonksiyonel gruplarının korunması için kritik öneme sahiptir.

İki dakikadan daha uzun süre UV ışığına maruz kalan hidrojeller, kırmızı ile gösterilen hareketsiz protein desenleri oluşturamaz. Ek olarak, protein modeline UV maruziyeti arttıkça, daha fazla protein yüzeye reaksiyona girer. Doğru şekilde hazırlandığında, hücreler davranışlarını manipüle etmek için bu desenli hidrojel substratlar üzerine kültürlenebilir.

Burada, endotel hücreleri, VEGF paterni PEG hidrojellerinin yüzeyine düzgün bir şekilde ekildi. Tohumlamadan iki gün sonra, endotel hücrelerinin, hareketsizleştirilmiş VEGF'yi içeren hidrojelin uzamsal bölgelerine doğru göç ettiği gözlendi. Bu protokolün geliştirilmesini takiben, araştırmacılar in-vitro hücre sistemleri için yeni biyoaktif platformları keşfetmek amacıyla herhangi bir protein veya peptidi hareketsiz hale getirmek için kullanabilirler.

Bu prosedürü denerken, hareketsiz hale getirilmiş moleküllerin biyo aktivitesini korumak için foto başlatıcı konsantrasyonunu ve UV maruz kalma süresini en aza indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, biyoaktif proteinleri ve peptitleri PEG hidrojelleri üzerine nasıl modelleyeceğinizi, hücreleri hidrojeller üzerine eşit şekilde nasıl tohumlayacağınızı ve bunun sonucunda ortaya çıkan hücre tepkisini nasıl gözlemleyeceğinizi iyi anlamalısınız.