Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

Bu immünohistokimyasal boyama yönteminin genel amacı, koku alma duyu nöronlarının akson terminallerinde akson sıralama moleküllerinin birleşik ekspresyonunu görselleştirmektir. Bu yöntem, akson rehberliği, sinaps oluşumları ve koku alma duyu nöronlarının yenilenmesi gibi koku alma gelişimi alanındaki temel süreçleri karakterize etmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bilim adamlarının, bölümler arasındaki varyasyonu sürdürmeden koku soğancığındaki akson sıralama moleküllerinin ekspresyon modellerini karşılaştırmasına ve analiz etmesine izin vermesidir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü gömme adımının öğrenilmesi zordur, çünkü koku alma dokuları örneğinin kalıptaki konumunu ve açısını kelimelerle tanımlamak zordur. % 4 paraformaldehitin intrakardiyak perfüzyonu ile sabitlenmiş bir ila iki haftalık farelerin kafaları ile başlayın. Üst ve alt dişler arasındaki boşluğa bir makas bıçağı yerleştirin ve alt çene kemiğini çıkarmak için yatay olarak kesin.

Ardından, koku soğanı ve koku alma epiteli de dahil olmak üzere koku alma dokusunu bırakmak için fazla dokuyu forseps ve makasla kesin. Burun boşluğundaki havayı çıkarmak için koku alma dokusunu PBS'ye daldırın, ardından beynin arka kısmını çıkarmak için dikey bir kesi yapın ve koku dokusunu, kesilen ucu aşağı bakacak şekilde bir gömme kalıbının altına yerleştirin. Kalıbı optimum kesme sıcaklığı bileşiği ile doldurun ve ardından sıvı nitrojene batırın.

Doku ve OCT tamamen donduktan sonra, kriyostattaki dokuyu bir saat boyunca 20 santigrat derecede dengeleyin. Şimdi kriyostat ile koku soğancığının seri parasaggital kesitlerini yapın ve bunları MAS kaplı cam slaytlara yapıştırarak toplayın. Yapıştırdıktan sonra slaytları hemen bir fön makinesi ile kurulayın.

Kurutulmuş slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS ile yıkayarak immün boyamaya başlayın. Slaytları oda sıcaklığında% 5 blokaj çözeltisi ile bir saat inkübe ederek spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. Daha sonra, her slayta% 1 bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 400 mikrolitre bir birincil antikor kokteyli ekleyin.

Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini atın ve slaytları PBST ile her biri oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra her slayta 400 mikrolitre ikincil antikor ve PBS kokteyli ekleyin.

Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, çözeltiyi atın ve slaytları oda sıcaklığında PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Son olarak, her kızağa iki damla montaj ortamı uygulayarak, örtü kızağını yerleştirerek ve hava kabarcıklarını çıkararak kapak kızaklarını kızaklara monte edin.

Her florofor için uygun filtreyi kullanarak floresan mikroskobu ile floresan görüntüler elde edin. Doygunluk olmadan görüntünün floresan sinyallerini elde etmek için pozlama süresini ayarlayın. Glomerüler yapıyı GLUT2'nin immünofloresan sinyalleri ile tanımlayın.

Glomerüller içindeki akson sıralama moleküllerinin boyama yoğunluklarını ölçmek için resim J'yi kullanın. Bu görüntü, VGLUT2'ye karşı antikorlarla boyanmış iki haftalık bir fareden alınan parasaggital koku soğanı bölümünü, Kirrel2'yi kırmızı renkle göstererek, Semaforin 7A'yı yeşil renkle ve OLPC'yi mavi renkle göstermektedir. Birleştirilmiş görüntü, glomerüler ayrışmada yer alan akson sıralama moleküllerinin konumdan bağımsız bir mozaik desende ifade edildiğini göstermektedir.

Her glomerulus, presinaptik belirteç VGLUT2'nin floresan sinyalleri ile tanımlanır. Glomerüler yapılar kesikli çizgilerle çevrilidir. Akson sıralama moleküllerinin sinyal yoğunlukları her glomerulusta ölçüldü.

Burada görüldüğü gibi, akson sıralama molekülleri her glomerulusta farklı şekilde ifade edilir. Örneğin, glomerulus 3, yüksek OLPC seviyelerine, orta Semaforin 7A seviyelerine ve daha düşük Kirrel2 seviyelerine sahiptir ve bu fark, boyama yoğunluğunun ölçülmesiyle ölçülebilir. Glomerulus 4 ise yüksek OLPC seviyelerine ve daha düşük Kirrel2 ve Semaphorin 7A seviyelerine sahiptir.

Yine, bu fark lekelenme yoğunluğu ölçülerek ölçülebilir. Bu prosedürü denerken, PFA ile fiksasyon sonrası ve normalde önerilen sükroz çözeltisi ile tedaviyi atlamayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, tek koku soğanı bölümüne nasıl daha fazla glomerül yerleştirileceğini ve diğer beyin bölgelerine uygulanabilecek çoklu antikorlarla yüksek kaliteli immün boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Umut etmeyi unutmayın, bu yöntem gelecekteki deneylerinizde başarılı olmanıza yardımcı olacaktır.