Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Bu deneysel prosedürün genel amacı, bakteriyel konjugasyon kullanarak Escherichia coli veya Shigella flexneri'de yüksek yoğunluklu bir transpozon yerleştirme kütüphanesi oluşturmaktır. Bu teknik, bir Tn10 transpozonunun rastgele genomik eklenmesiyle yüz binlerce benzersiz bakteri mutantının oluşturulmasına izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, transpozonu barındıran plazma transferinin, elektroporasyon gibi diğer daha az verimli yöntemler yerine bakteriyel konjugasyon yoluyla yapılmasıdır.

Ek olarak, Tn10 transpozonunun kendisi, diğer transpozonlardan daha az önyargı ile genoma eklenir. Steril teknik kullanarak, donör suşunun bir mililitre gece boyunca kültürünü steril bir eppendorf tüpüne ekleyin. Tüp, donör için örneğin bir D ile etiketlenmelidir.

Alıcı suşu için de aynısını yapın, alıcı suşunun gece boyunca bir mililitre kültürünü steril bir eppendorf tüpüne çıkarın. Yine örneğin, alıcı için R ile etiketlenmiş. Her iki tüpü de oda sıcaklığında 14.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin.

Bu, bir tezgah üstü santrifüjde yapılabilir. Santrifüj çalışırken, filtreleri konjugasyon için hazırlayın. Antibiyotik içermeyen etiketli bir LB agar plakasına nitroselüloz filtre yerleştirmek için steril forseps kullanın.

Alternatif olarak, nitroselüloz filtre yerine steril kurutma kağıdı kullanılabilir. Kirlenmeyi en aza indirmek için her filtreyi ayrı bir LB agar plakasına yerleştirin. Her filtrenin uygun şekilde etiketlenmiş bir LB agar plakasına yerleştirildiğinden emin olun.

Her biri bir filtre içeren üç plaka yapın. Biri donör suşu için, biri alıcı suşu için ve diğeri kütüphane için. Santrifüj bittiğinde, gece boyunca kültürleri çıkarın.

Antibiyotik içeren tüm büyüme ortamını eppendorf tüpünden çıkarın ve atın. Bakteri hücresi paletini bozmamaya veya rahatsız etmemeye dikkat edin, ancak tüm büyüme ortamını çıkarmaya çalışın. Aseptik olarak çalıştığınızdan ve her numune arasında uçları değiştirdiğinizden emin olun.

Her eppendorf tüpüne, antibiyotiksiz 110 mikrolitre taze LB ortamı ekleyin ve kültürü yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Aseptik olarak çalıştığınızdan emin olun. Hücre kümeleri kalmadığından emin olmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek.

Bu adım, bakteri kültürünü konsantre etmek ve gece boyunca kültürden kalan antibiyotikleri uzaklaştırmak için yapılır. Bir pipet kullanarak, 50 mikrolitre konsantre donör kültürünü Donör etiketli filtreye yerleştirin. 50 mikrolitreyi yavaş yavaş filtreye damla damla ekleyin.

Aynısını alıcı suşu için de yapın, 50 mikrolitre yeniden askıya alınmış kültür, konsantre yeniden süspanse edilmiş kültür, alıcı filtreye damla damla akın bir şekilde ekleyerek. Konjugasyonun gerçekleşmesi için, hem alıcı suşu hem de donör suşu aynı filtre kağıdına eklenir, böylece yakın fiziksel temas halinde olurlar. Bunu yapmak için, hem donör suşundan hem de alıcı suşundan 50 mikrolitre kütüphane etiketli plakadaki aynı filtreye ekleyin.

Filtreleri içeren bu agar plakalarını altı saat boyunca 37 derecede yerleştirin. Konjugasyon işlemi 37 santigrat derecede altı saat boyunca gerçekleşir. Konjugasyon sırasında, pJA1 plazmini alıcı suşuna hareket eder.

Konjugasyondan sonra, bakteriler girdap yoluyla filtreden ayrılır ve bir milimolar IPTG ile indüklenir. IPTG, transpozazı indükler ve Kanamisin direnci genini içeren transpozon, alıcı suşun genomuna rastgele yerleştirilir. Bakteriler, transpozon içeren alıcı suşu seçmek için kanamisin ve başka bir antibiyotik içeren LB agar plakaları üzerine kaplanır.

Alıcı suşu Lambda pir negatiftir, bu nedenle pJA1 plazmini kaybolur. 37 santigrat derecede altı saatlik büyümeden sonra konjugasyon tamamlanır. Filtreleri içeren plakaları inkübatörden çıkarın.

Negatif donör kontrolünü içeren filtreyi LB agar plakasından çıkarmak için steril forseps kullanın. Filtre kağıdını konik şişenin altına almak için tüpe hafifçe vurun ve filtrenin LB ortamına tamamen daldırıldığından emin olun. Bu tüp, IPTG'li iki mililitre LB ortamı ve bir milimolar nihai konsantrasyon içerir.

Bakterileri nitroselüloz filtreden ayırmak için tüpü bir dakika boyunca vorteksleyin. LB ortamı bakteri hücreleri ile bulanık hale gelmelidir. Bu işlemi hem alıcı denetimi hem de kitaplık için de yineleyin.

Bakteri hücrelerini içeren filtreler, bakterileri filtreden ayırmak için iyice vortekslendikten sonra, bakteri hücreleri seçilen ortam üzerine kaplanır. Bu aşamada bakteriler, kanamisin ve nalidiksik asit gibi başka bir antibiyotik içeren LB agar plakalarına kaplanır. Kanamisin, genoma başarılı bir şekilde entegre edilmiş kanamisin direnç markörünü içeren transpozona sahip alıcı hücreleri seçmek için kullanılır.

Genoma entegre edilmiş işaretleyiciye sahip olmayan alıcı hücreler karşı seçilir. Donör suşuna karşı seçim yapmak için nalidiksik asit gibi başka bir antibiyotik kullanılır. Burada kullanılan donör suşu nalidiksik aside duyarlıyken, alıcı suşu nalidiksik aside dirençlidir.

Bu ikinci antibiyotiği kullanarak, donör suşunu çıkarmak mümkündür. Bu adımda, yeterli aralıklarla yerleştirilmiş birçok koloni veren kütüphanenin bir seyreltmesini belirlemek için birkaç seyreltme kaplanmalıdır. Transpozon kütüphanesini içeren tüm plakalardaki koloni sayısını saydıktan ve kaydettikten sonra, bazı kullanıcılar kütüphaneyi tek bir tüpte toplamak veya birleştirmek isteyebilir.

Bu, steril bir yayıcı kullanılarak yapılabilir. Transpozon kütüphanesini içeren LB agar plakasına bir mililitre LB ortamı ekleyin. Ortam plakaya eklendikten sonra, bakterileri plakadan sıyırmak ve ayırmak için steril yayıcıyı kullanın.

Tüm bakterileri plakadan çıkarmak çoğu zaman mümkün değildir. Bakteriyel süspansiyonu çıkarın ve 50 mil veya 15 mil konik bir vile yerleştirin. Bunu tüm plakalar için tekrarlayın.

Tüm plakalar kazındıktan sonra, herhangi bir hücre kümesini parçalamak için havuzlanmış bakteri süspansiyonunu tam bir dakika boyunca girdaplayın. Bu artık havuza alınan kitaplığı oluşturur. 37 derecede 18 saat büyüme sonrası donör veya alıcı kontrol plaklarında büyüme olmamalıdır.

Mutant kütüphaneyi içeren plakalar ideal olarak çeşitli boyutlarda birçok koloni içerir. Farklı koloni boyutları, farklı uygunluktaki klonları gösterdi ve protokolün işe yaradığının iyi bir işareti. Bakterilerde yoğun bir transpozon mutajenez kütüphanesinin oluşturulması, virülans genlerinin ve bakteri patojenlerinin keşfinden temel genlerin incelenmesine ve genetik etkileşim ağlarının tanımlanmasına kadar birçok alt uygulama için potansiyel olarak avantajlıdır.

Bu aşağı akış uygulamalarının tümü, yoğun bir transpozon yerleştirme kütüphanesinin oluşturulmasına dayanır. Burada sunulan yöntem, E coli veya Shigella flexneri gibi enterobakteriyel suşlarda çok yoğun bir transpozon kütüphanesi yapmak için basit, hızlı ve ucuz bir prosedür sağlar.