Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Bu yöntem makalesinin genel amacı, kimyasal olarak modifiye edilmiş peptit nükleik asitler tarafından çift sarmallı RNA'ların moleküler tanınmasını incelemek için laboratuvarımız tarafından kullanılan ayrıntılı protokolleri tanıtmaktır. Bu yöntem, RNA yapılarının tespiti ve hedeflenmesi gibi RNA kimyasal biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tasarım ilkelerinin herhangi bir RNA dubleks yapısının hedeflenmesine uygulanabilmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Desiree Toh olacak. Bu işleme başlamak için, önceden hazırlanmış RNA PNA örneklerine dört mikrolitre% 35'lik bir gliserol çözeltisi ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bir mikropipet ve jel yükleme uçları kullanarak, her numuneden 20 mikrolitreyi önceden hazırlanmış bir poliakrilamid jele dikkatlice koyun ve herhangi bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat edin.

Jeli beş saat boyunca 250 voltluk sabit bir voltajda çalıştırın. Beş saat sonra, güç kaynağını kapatın ve cam plakayı jel standından çıkarın. Ardından jel sızdırmazlık bandını çıkarın ve cam plakayı sökün.

Jeli cam plakadan yavaşça çıkarın ve 350 mililitre deiyonize su ile dolu bir kaba koyun. Kabın içine dikkatlice 35 mikrolitre etidyum bromür ekleyin ve 30 dakika boyunca düşük hızda platform çalkalayıcıya yerleştirin. Etidyum bromür çözeltisini attıktan sonra, jeli 1.5 ila iki litre damıtılmış su ile durulayın.

Ardından, 532 nanometre yeşil lazerli bir görüntüleyici ve 610 nanometreye ayarlanmış emisyon filtresi kullanarak jeli tarayın. Özgür yazılım kullanarak jel bant yoğunluklarını ölçün. Uygun miktarda 2-aminopurin etiketli çift sarmallı RNA'yı temiz 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Daha sonra RNA çözeltilerini bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak konsantre edin. Daha sonra, önceden hazırlanmış ana stoktan çeşitli konsantrasyonlar için hedeflenen PNA'nın uygun hacimlerini ayrı 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Vakum yoğunlaştırıcıyı kullanarak PNA çözeltilerini konsantre edin.

Kurutulmuş RNA'yı içeren tüpe 975 mikrolitre inkübasyon tamponu ekleyin ve tüm RNA'nın çözündüğünden emin olmak için iyice karıştırın. RNA çözeltisini kısa bir süre santrifüjledikten sonra, tüpü 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirerek tavlamaya tabi tutun. Bittiğinde, ısı bloğunu kapatın ve numunenin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Kurutulmuş PNA içeren tüplerin her birine 75 mikrolitre RNA ekleyin ve iyice karıştırın. Numunelerin oda sıcaklığında en az bir saat beklettikten sonra, gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Şimdi, uygun miktarlarda 2-aminopurin etiketli tek sarmallı RNA'yı ayrı 1.5 mililitrelik tüplere aktarın.

Çeşitli konsantrasyonlar için uygun hacimlerde hedeflenen PNA'yı ana stoktan tek sarmallı RNA'yı içeren ilgili tüplere aktarın. Numuneleri kuruttuktan sonra, tüplerin her birine 75 mikrolitre inkübasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Her bir tüpü 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirerek her numuneyi tavlamaya tabi tutun.

Numunelerin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra, gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bunu takiben, her numuneden 70 mikrolitreyi bir santimetre karelik bir küvete aktarın. Küveti bir floresan spektrofotometresine yerleştirin ve 330 ila 550 nanometre dalga boyu aralığındaki emisyonu ölçün.

Ölçüm tamamlandıktan sonra tamponu küvetten çıkarın. Küveti damıtılmış suyla durulayın ve nitrojen gazı ile kurulayın. Tüm numuneler için ölçümü tekrarladıktan sonra, floresan yoğunluğunu dalga boyuna göre çizin.

Uygun miktarlarda tek sarmallı RNA'yı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Daha sonra uygun hacimlerde hedeflenen PNA'yı ana stoktan tek sarmallı RNA'yı içeren ilgili tüplere aktarın. Numuneleri kuruttuktan sonra, tüplerin her birine 130 mikrolitre inkübasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.

Her bir tüpü 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirerek her numuneyi tavlamaya tabi tutun. Numunelerin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra, gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Şimdi, her numunenin 130 mikrolitresini, bir hücreli inkübasyon tamponu içeren sekiz mikro hücreli bir küvete aktarın.

Bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak, her bir numunenin absorbansını 260 nanometrede ölçün. 15 ila 95 santigrat derece arasında artan sıcaklıkta ölçün, ardından dakikada 0,5 santigrat derecelik bir rampa hızında 95 ila 15 santigrat derece arasında azalan sıcaklıkta ölçün. PNA oligomerleri, iki ters faz HPLC saflaştırmasından sonra elde edildi.

PNA'ların kimliği MALDI/TOF analizi ile doğrulanabilir. Dansatüre olmayan PAGE verileri, Q ve L modifiyeli PNA'nın yalnızca bir C-G çifti ile çift sarmallı RNA bölgesini tanıyabileceğini göstermektedir. Bu spesifik ve gelişmiş tanıma, T-A-U-L-G-C ve Q-C-G PNA RNA iki tabanlı üçlü oluşum yoluyla gerçekleşir.

Bir 2-aminopurin floresan titrasyon çalışması, bir Q ve L modifiye PNA'nın hedeflenen çift sarmallı bir RNA'ya bağlandığını, ancak tek sarmallı RNA'ya bağlanmadığını gösterdi. Q kalıntıları içeren PNA'lar, Watson Watson-Crick benzeri Q-G çiftindeki sterik çatışma nedeniyle tek sarmallı RNA'ya bağlanma olmadığını düşündüren termal erime geçişleri göstermez. Modifiye edilmemiş PNA P1 ile karşılaştırıldığında, L kalıntıları içeren PNA P4 ve P5, Watson-Crick benzeri L-G çiftindeki sterik çatışma nedeniyle karşılık gelen RNA PNA dupleksleri için daha düşük bir erime sıcaklığı gösterir.

UV absorbansı tespit edilen termal erime verileri, Q ve L kalıntıları içeren bir PNA'nın tek sarmallı RNA'ya güçlü bir şekilde bağlanmadığını gösteren 2-aminopurin floresan titrasyon verileriyle tutarlıdır. Bir Q bazının dahil edilmesi, bir L bazından daha dengesizleştiricidir, çünkü bir Q tabanı, bir Watson-Crick benzeri Q-G çiftinin oluşumunda daha önemli bir sterik çatışmaya sahiptir. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa çeşitli deneyler bir hafta içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, çift sarmallı RNA bağlayıcı PNA'ları kullanarak RNA yapılarını tespit edip edemeyeceğimiz ve RNA fonksiyonlarını düzenleyip düzenleyemeyeceğimiz gibi ek soruları yanıtlamak için hücrelerdeki RNA yapılarının araştırılması ve hedeflenmesi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, RNA biyolojisi ve hastalığı alanındaki araştırmacıların RNA yapısını hedeflenen terapötik gelişimi keşfetmelerinin yolunu açtı.