Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Bu yöntemin genel amacı, makrofaj hücre dışı tuzaklarının konfokal mikroskopi kullanılarak nasıl görselleştirilebileceğini ve incelenebileceğini göstermektir. Bu yöntem, enfeksiyona ve diğer bağışıklık uyaranlarına verilen yanıtlar gibi iltihaplanma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nötrofil hücre dışı tuzakları incelemek için kullanılan iyi bilinen bir yöntemin bir modifikasyonu olmasıdır.

Bu prosedürü gösteren Roleen Sharma olacaktır. Metin protokolüne göre bronkoalveoler lavaj veya BAL ile insanlardan ve farelerden akciğer makrofajları elde ettikten sonra, BAL çözeltisi üzerinde canlı bir hücre sayımı yapmak için tripan mavisi ve bir hemositometre kullanın. 500 mikrolitre kültür ortamında bir ila dört kez 10 ila beşinci makrofajları 24 oyuklu plakaların oyuklarındaki örtü fişlerine pipetleyin, ardından hücrelerin yapışması için hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Daha sonra% 2 paraformaldehit-periodat-lizin veya PLP fiksatif ekleyin ve numuneleri 10 dakika inkübe edin. Hücreleri kısaca yıkamak için PBS'yi kullandıktan sonra, PBS'ye% 0.2 TWEEN 20 ekleyin ve hücreleri 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri bloke etmek için,% 5 BSA içinde% 10 tavuk serumu ekleyin, PBS'de seyreltin ve örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra blok çözeltisini bir ila 100 konsantrasyonda birincil ve izotop kontrol antikorları ile değiştirin ve hücreleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, karşılık gelen ikincil antikorları eklemeden önce hücreleri yıkamak için PBS kullanın.

Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS'de yıkadıktan sonra, numuneleri DAPI bazlı montaj ortamı ile monte edin, ardından numuneleri konfokal bir mikroskop kullanarak görselleştirin. FFPE örneklerini antijen alma çözeltisi ile ön işleme tabi tutmak için, slaytları 60 santigrat derecede 60 dakika fırında kurutun.

Daha sonra, numuneleri beş dakika boyunca oda sıcaklığında% 70 etanole aktarmadan önce slaytları 30 dakika boyunca ksilen çözeltisine aktarın. Slaytları durulamak için musluk suyu kullandıktan sonra, ısıya dayanıklı plastik sargıya koyun ve 10 dakika boyunca Tris-EDTA pH 9.0'da bir düdüklü tencereye koyarak daha yüksek antijen alımına tabi tutun. Numuneleri 20 dakika soğutun ve musluk suyuna aktarın.

Sonra onları beş dakika boyunca bir külbütöre yerleştirin. Musluk suyuyla yıkamayı tekrarlayın ve ardından slaytları külbütör üzerindeki PBS'de bir kez yıkayın. Örnekleri bloke etmek için, %5 BSA PBS'ye %10 tavuk serumu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, makrofaj hücre dışı tuzakları veya makrofajlardaki MET'leri tanımlamak için,% 1 BSA PBS'de bir ila 100 primer antikor seyreltmesi ekleyin ve slaytları 16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri her biri beş dakika boyunca bir külbütör üzerinde iki kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Karşılık gelen floresan ikincil antikorları% 1 BSA PBS'ye ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.

PBS yıkamalarından sonra, kromatini lekelemek ve numuneleri monte etmek için DAPI içeren montaj ortamı kullanın. Ters çevrilmiş bir mikroskoba bağlı konfokal bir lazer tarama kafası kullanarak, 20X 0.1 NA hava ve 40X 1.0 NA yağ hedefleri kullanarak floresan görüntüler yakalayın. Çizgi Sıralı tesviye düğmesine tıklayarak tek düzlem 512 x 512 piksel görüntüler yakalayın.

Analiz için bölüm başına en az 10 görüş alanı ve her sonuç için veri elde edin. Mikrosantrifüj tüplerindeki bölümleri boyamak için, ilgili birincil antikorları 200 mikrolitrelik hacimlere ekleyin ve numuneleri 16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Uygun ikincil antikorları eklemeden ve numuneleri oda sıcaklığında bir saat inkübe etmeden önce PBS'deki bölümleri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Akciğer bölümlerini çözelti içinde boyamak için DAPI kullanın ve PBS'deki mikroskop slaytları üzerindeki bölümlere kapak fişleri eklemeden önce numuneleri 20 dakika inkübe edin. Görüntü yakalamak ve optimum Z kesiti ile 0,54 mikron kalınlığında 3D Z yığınlarını kaydetmek için 405 nanometre, 440 nanometre, 473 nanometre, 543 nanometre ve 635 nanometre lazerle donatılmış, 40X 1,3 NA objektifli ters konfokal bir mikroskop kullanın. Son olarak, görüntüleri metin protokolüne göre analiz edin.

Bir BAL örneğindeki MET'lerin bir örneği burada gösterilmiştir. İlk tespit edilebilir özellik, kabaca küresel bir şekle sahip olan bu erken aşama MET'te görüldüğü gibi, çekirdeğin hücrenin kenarına doğru hareketidir. Bunu, bu daha olgun MET'de görüldüğü gibi, H3Cit ve granüler proteazlar gibi diğer birlikte eksprese edilen aracılarla hücre dışı kromatin takip eder.

Daha erken evre MET sol üsttedir ve daha sonraki evre MET bunun altında merkeze doğru yer alır. Akciğer dokusu MET'leri bu şekilde gösterilmiştir. Akciğerler, akciğer mimarisini tanımlamak için sıvı ile şişirildiğinden, MET'ler alveolar duvarlara doğru itilecektir.

MET'lerin morfolojisi, dokunun hangi düzlemde kesildiğine bağlı olarak da değişecektir. Akciğer dokusu örnekleri için kullanılan standart bölümler dört ila beş mikron kalınlığındadır. Daha kalın doku kesitleri, birden fazla görüntünün alınmasını sağlar ve MET'ler daha sonra 3D olarak görüntülenebilir.

25 ila 35 mikronluk kesitler halinde kesilmiş fare akciğer dokusundan alınan bir 3D görüntü örneği burada sunulmuştur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki günlük boyama ve görüntüleme ile yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yıkamalara karşı nazik olmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, proteaz ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak için zymografi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik inflamatuar makrofaj yanıtlarının incelenmesi için yol açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, konfokal mikroskopi kullanarak MET'leri nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

PLP ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve göz koruması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.