Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Bu dizi tabanlı karşılaştırmalı genomik hibridizasyon protokolünün genel amacı, baklagil bitkisi Medicago truncatula'nın hızlı nötron bombardımanının neden olduğu mutantlarındaki kopya sayısı varyasyonlarını hızlı bir şekilde tanımlamaktır. Bu yöntem, baklagil biyolojisi alanındaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olur. Örneğin, baklagillerde nodül gelişiminin düzenlenmesinde rol oynayan düşük bölgedeki empatojenlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.

Bu tekniğin temel avantajı, baklagil bitkisi Medicago truncatula'nın nötron bombardıman mutantlarındaki delesyon mutasyonları gibi kopya sayısı varyasyonlarını tespit etmede en yüksek itibara sahip ve hassas olmasıdır. Bu prosedürü gösteren ben ve Genetik Laboratuvarı'ndan Ev Sahibi Doktor Arkadaşları Hongcheng Wang olacak. Tek bitkilerden toplanan bir gram genç yaprak dokusunu sıvı nitrojen içinde hızla dondurun.

Daha sonra bir havan ve havaneli kullanın ve donmuş yaprak dokusunu sıvı nitrojen içinde ince toz haline getirin. Bir DNA izolasyon kiti kullanarak vahşi tip ve mutant genomik DNA örneklerini ince tozdan çıkarın. Her vahşi tipten bir mikrogram seyreltmek için 500 mikrolitrelik santrifüj tüpleri ve mutant genomik DNA'ları çift damıtılmış su ile 20 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar kullanın.

Ardından, santrifüj tüplerine beş mikrolitre rastgele astar ekleyin. Tüpleri hızlı bir şekilde girdaplayın ve hızlı bir şekilde döndürdükten sonra, DNA örneklerini 98 santigrat derecede denatüre etmek için 10 dakika boyunca bir termo döngüleyiciye yerleştirin. 10 dakika sonra tüpleri termocycler'dan çıkarın ve anında beş dakika boyunca buzlu suya koyun.

Daha sonra, iki etiketleme karışımı hazırlayın ve 25 mikrolitre etiketleme karışımını sırasıyla vahşi tip ve mutant DNA tüplerine bir ve iki olarak ekleyin. DNA'yı ve etiketleme karışımını üç kez pipetleyin ve ardından tüpleri kısaca döndürün. Eğirme işleminden sonra, tüpleri termosiklerde iki saat boyunca 37 santigrat derecede ve ardından ekzo Klenow enzimini etkisiz hale getirmek için 65 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Ardından, 430 mikrolitre One X TE Buffer ekleyin ve her bir tüpteki içeriği karıştırın. Daha sonra, tüpleri kısaca döndürün ve tüplerdeki çözeltiyi iki mililitrelik toplama tüpü ile saflaştırma kolonlarına aktarın. Arıtma kolonlarını 10 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin ve akışı atın.

Her sütuna 480 mikrolitre Bir X TE Tamponu ekleyin ve tekrar 10 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin. Akışı atın. Yabani tip ve mutant etiketli DNA'ların her birini sütunun altından yeni santrifüj tüplerine aktarın.

Etiketli DNA'ların her birinin hacmini pipetle ölçtükten sonra, son hacmi One X TE Buffer ile 80 mikrolitreye ayarlayın, ardından etiketli DNA'ların konsantrasyonunu bir spektrofotometrede ölçün. Daha sonra, karşılaştırmalı hibridizasyon için bir mikro dizi çipi üzerinde probları hibritleştirmek için eşdeğer hacimlerde mutant ve vahşi tip DNA'ları karıştırın. One X TE Buffer ile son hacmi 160 mikrolitreye getirin.

Daha sonra, hibridizasyon çözeltisini hazırlayın ve üç ajanı karışık DNA ile iyice karıştırmak için üç kez pipetleyin. Tüpleri kısa bir süre döndürdükten sonra, 98 santigrat derecede 10 dakika ve 37 derecede 20 dakika boyunca bir termosiklerde inkübe edin. Hibridizasyondan dört saat önce hibridizasyon fırınını önceden ısıtmak için sıcaklığı 67 santigrat dereceye ayarlamayı unutmayın.

Ardından, hibridizasyon odasının tabanına bir conta sürgüsü yerleştirin ve termocycler'da 37 santigrat derecede 20 dakikalık inkübasyondan sonra üzerine 490 mikrolitre hibridizasyon çözeltisi yükleyin. Hibridizasyon odasını oluşturmak için conta sürgüsünü Medicago truncatula genom mikro dizi çipi ile kaplayın, ardından hibridizasyon odasını kapatın ve kelepçelerle güvenli bir şekilde sıkın. Monte edilmiş hibridizasyon odasını hibridizasyon fırınında 67 santigrat derecede 40 ila 48 saat inkübe edin.

Bu arada, oda sıcaklığında tutulan 250 mililitre Yıkama Tamponu Bir ile iki slayt yıkama kabı hazırlayın. Ardından, 37 santigrat derecede tutulan Yıkama Tamponu İki ile bir slayt yıkama kabı yapın. Ardından, 70 mililitre asetonitril içeren bir slayt yıkama kabı ve 70 mililitre stabilizasyon ve çekme çözeltisi içeren başka bir slayt yıkama kabı hazırlayın.

Her iki sürgülü yıkama kavanozunu da oda sıcaklığında bir davlumbaz içine yerleştirin. İnkübasyondan sonra, hibridizasyon odasını hibridizasyon fırınından çıkarın ve kapağı açmak için hazne kelepçelerini gevşetin. Ardından, conta sürgüsündeki mikro dizi çipini çıkarın ve bunları Wash Buffer One ile sürgülü yıkama kabına yerleştirin.

Mikro dizi çipini kapak kızağından izole edin. Ardından, mikro dizi çipini Wash Buffer One ile ikinci sürgülü yıkama kabına aktarın. Bir karıştırma çubuğu kullanarak, çözeltiyi oda sıcaklığında manyetik bir karıştırma plakası üzerinde beş dakika boyunca hafifçe karıştırın.

Mikro dizi çipini önceden ısıtılmış Yıkama Tamponu İki ile sürgülü yıkama kabına yerleştirin, ardından çözeltiyi 37 santigrat derecede bir dakika yıkamak için karıştırma çubuğu ile karıştırın. Mikro dizi çipini çıkarın ve 30 saniye boyunca yıkamak için çeker ocaktaki asetonitril içeren sürgülü yıkama kavanozuna yerleştirin. Mikro dizi çipini stabilizasyon ve kurutma solüsyonu ile sürgülü yıkama kavanozuna aktarın ve tekrar 30 saniye yıkayın.

Çipi dikkatlice çıkarın ve çeker ocak içinde bir dakika kurutun. Mikro dizi çipini iki mikrometre çözünürlüğünde bir tarayıcı kullanarak tarayın. Sekiz kromozom boyunca normalleştirilmiş log iki oranlarında mutant ve vahşi tip sinyallerin dağılımını analiz etmek için bir arayüz olarak bir sinyal haritalama yazılımı kullanıldı.

Varsayılan silmeler için, eksi iki nokta beş standart sapmaya eşit veya daha küçük log iki oranının değeri dikkate alınır. Yazılımın segmentasyon analizi, grafikte gösterilen kromozom dört üzerinde tahmini 22 kilobaz delesyon bölgesini göstermektedir. Mikro dizi probları tarafından kuşatılan delesyon sınırlarının analizi, azaltılmış bir ortalama normalleştirilmiş log iki oranı göstermektedir.

Grafik ayrıca, silinen bölgeyi kapsayan oğul geni de dahil olmak üzere diğer altı açıklamalı geni göstermektedir. Son geni, Metecago truncatula'da nodülasyonu kontrol etmekten sorumludur. Daha sonra, delesyon sınırlarını doğrulamak için yapılan PCR amplifikasyonu, FN6191 mutantından amplifiye edilmiş, ancak vahşi tipte olmayan, bir nokta beş kilobaz ürünü gösterir.

Siyah okla gösterilen FN6191 mutantındaki delesyon bağlantısını göstermek için DNA dizilimi yapıldı. Silme kenarlıklarının konumunu doğrulayan sıralama da yapıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 72 saat içinde tamamlanabilir.

Yüksek kaliteli veriler elde etmek için, prosedürün gerçekleştirildiği odadaki ozon konsantrasyonunu düşük tutmayı unutmayın. Bu prosedürü takiben, genomdaki boyut ve kopya sayısı varyasyonları gibi ek soruları yanıtlamak için tüm genom dizilemesinin polimeraz zincir reaksiyonları gibi diğer ölçümler gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin etkinliği ve doğrulanması, araştırmacıların mutantlara indükledikleri kopya sayısı varyasyonunu ve Garden P gibi eklemesel mutajeneze uygun olmayan bitki türlerindeki doğal varyantları keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

Göz koruması takmak, ajanlarla doğrudan temastan kaçınmak ve dikkatli çalışmak gibi önlemler kesinlikle gereklidir.