Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Bu metodolojinin genel amacı, zerbrafish larvalarının mikroenjeksiyonunu daha kolay ve daha doğru hale getirmektir. Bu yöntem, zebra balığı model sistemlerini kullanan araştırmacıların, zebra balığı larvalarını büyük diziler halinde belirli yönelimlerde hareketsiz hale getirmelerine yardımcı olur. Teknik, mikroenjeksiyon ve görüntüleme için belirli dokulara daha kolay erişim sağlar ve enfeksiyon veya ksenogreft kanseri modelleri gibi uygulamalar için çok sayıda larva gerektiğinde çok etkilidir.

Zebra balığı modellerindeki üretim stratejilerim son derece tamamlayıcıdır. Biri insan yapımı ve basit. Diğeri canlı ve karmaşıktır.

Her ikisi de aynı boyut ölçeğini paylaşır. İkisi de şeffaftır. Ve her ikisi de tek hücre çözünürlüğünde gözlemleri mümkün kılar.

Burada gösterdiğiniz gibi, kolayca birleştirilebilirler ve hemen hemen her büyük hastalığın incelenmesi için uygulamaları olabilir. Metin protokolüne göre ince bir E-3 filmi ile kaplı bir Petri kabında bir PDMS bloğu hazırladıktan sonra, gerekli sayıda embriyoyu PDMS bloğunun yüzeyine aktarmak için bir transfer pipeti kullanın. Bir saç halkası veya benzeri bir alet kullanarak, embriyoları, özellikle dorsal ve ventral yönelimler için mikro yapı bölmelerine itin.

Larvaları bölmelere yüklerken, kolay manipülasyona izin vermek için PDMS bloğunu kaplayan yeterli suya sahip olmak önemlidir. Enjeksiyon sırasında yerinde kalmaları için onları bölmelere itmek de önemlidir. Zebra balığını önceden metin protokolüne göre hazırlanmış mikro yapı kanallarına yönlendirmek için, desenli PDMS bloğundan E-3'ü çekmek için bir transfer pipeti kullanın.

E-3 seviyesi bloğun kenarının altına düşmeli, ancak yine de rezervuar ve kanallarda bulunmalı ve PDMS üzerinde ince bir tabaka kalmalıdır. Bir transfer pipeti kullanarak, 10 anestezi uygulanmış embriyoyu, kenarların taşmamasına dikkat ederek rezervuara aktarın. Bir saç halkası kullanarak, her bir embriyoyu önce uygun kanalın girişinde huni kafasına manipüle edin ve embriyonun kanala girerken uygun oryantasyona sahip olduğundan emin olun.

Ardından, her bir embriyoyu, onu yerinde tutan kanal duvarlarındaki yönlendirme mikro özelliklerine ulaşana kadar kanaldan aşağı kaydırmak için bir saç halkası kullanın. Mikroenjeksiyon iğneleri ve mikroenjeksiyon solüsyonunun hazırlanmasını takiben, solüsyonun beş mikrolitresini iğneye yüklemek için ince konik bir pipet ucu kullanın. İğneyi manyetik bir stand üzerine monte edilmiş bir mikromanipülatöre monte edin ve bir PICO pompa mikro enjektörüne bağlayın.

Ardından, konik ucu sıkıştırarak bir iğnenin ucunu 45 derecelik bir açıyla kırmak için forseps kullanın. PICO pompa kontrol cihazında enjeksiyon süresini ayarlayarak enjeksiyon bolus boyutunu bir nanolitreye ayarlayın. Mikromanipülasyon kontrolörü üzerindeki mikroenjeksiyon iğnesinin açısını, iğne embriyonun uzunluğuna paralel olacak şekilde 45 dereceden başlayarak ayarlayın.

Mikroenjeksiyon sırasında embriyonun yanal hareketini en aza indirmek için daha dik bir açı kullanılabilir. Petri kabını sol elinizle kontrol etmek ve sağ elinizle mikromanipülatöre ihtiyaç duymak, iğneyi otik vezikül gibi amaçlanan mikroenjeksiyon bölgesine mümkün olduğunca yaklaştırın. Mikromanipülasyon denetleyicisini kullanarak iğneyi hedef dokuya yerleştirin ve önceden ayarlanmış hacmi enjekte etmek için PICO pompa ayak pedalını kullanın.

Doku penetrasyona direniyorsa, mikromanipülasyon kontrol düğmesine hafifçe dokunun. Embriyoları serbest bırakmak için, E-3'ü yüzey üzerinde yukarıdan aşağıya doğru akıtmak için bir transfer pipeti kullanın veya tabağı, embriyolar çevreleyen E-3'e salınacak şekilde döndürün. Embriyoları MS-222 içermeyen bir E-3 kurtarma kabına aktarın.

PDMS cihazını kullanarak embriyoları altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarında taramak için, 1.000 mikrolitrelik bir pipet veya dar uçlu bir transfer pipeti kullanın, böylece E-3'ü porttan geçirerek cihazı astarlayın. Cihaz kaplanana kadar kuyuyu doldurmak için E-3 ve MS-222'yi kullanın. Ardından, daha önce enjekte edilmiş dört embriyoyu her bir oyuğa vermek için bir transfer pipeti kullanın.

Bir saç halkası veya benzeri bir alet kullanarak, embriyoları görüntüleme kanallarının girişlerine istenen yönde yerleştirin ve kısmen cihazın içine itin. Bu, onları cihaza eşit şekilde çekmeye yardımcı olacaktır. 1.000 mikrolitrelik bir pipet veya transfer pipeti kullanarak, embriyolar görüntüleme için doğru yönde kanallara çekilene kadar E-3'ü porttan cihazdan çekin.

Kuyu plakasını ters çevrilmiş bir floresan mikroskoba aktarın. Embriyoları görüntülemek için, zebra balığı neturaohil göçünü görüntülemek için 10x gibi uygun lensi seçerek büyütmeyi ayarlayın. Her kanal için ışık kaynağı yoğunluğunu ve maruz kalma süresini, her sinyalin net olması, ancak doygun olmaması için ayarlayın.

Son olarak, her floresan ve iletilen kanal için görüntü yakalayın. Embriyoları lateral oryantasyonda stabilize etmek için mikroyapılı kanal cihazı kullanılarak, nötrofillerin döllenmeden iki gün sonra zebra balığı embriyolarının otik veziküllere mikroenjekte edilen standart kemoatraktanlar fMLP ve LTB4'e yanıt verme yeteneği test edildi. Nötrofil alımını görselleştirmek için, enjeksiyonlar yüksek moleküler ağırlıklı rodamin dekstran ile izlendi ve yeşil floresan nötrofiller içeren transgenik embriyolarda gerçekleştirildi.

Enjekte edilmemiş embriyolar ve tek başına rodamin enjekte edilen embriyolar negatif kontrol olarak kullanıldı. Mikroenjeksiyonu takiben embriyolar görüntüleme kanalı cihazına transfer edildi ve enjeksiyondan 30 dakika ve beş saat sonra EVOS floresan mikroskobu ile görüntülendi. Beklendiği gibi, az sayıda floresan nötrofil, muhtemelen hasarlı aracılı işe alım nedeniyle, erken zaman noktasında sahte enjekte edilen otik veziküle alındı.

İlginç bir şekilde, rodamin dekstran izleyicisinin deney sırasında otolitlerde biriktiği gözlemlendi. Her iki kemoatraktan için, özellikle LTB4'e yanıt olarak nötrofiller daha yüksek sayılarda işe alındı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik zebra balığı mikroenjeksiyonunun hızını ve doğruluğunu büyük ölçüde artırabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesi, laboratuvarımızdaki belirli zorluklar tarafından yönlendirildi. Bu yaklaşımı, zebra balığı modellerinde mantar enfeksiyonu ve tümör ksenogreftleri ile ilgili projelerimizin ihtiyaçlarına uyacak şekilde geliştirdik. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı mikroenjeksiyonu ve uzun süreli canlı görüntüleme için mikro yapılı yüzey dizilerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.