Beyin omurilik sıvısı imzalat fareler gelen topluluğu için geliştirilmiş bir yöntem
19 Mart 2018
Bu iletişim kuralı beyin-omurilik sıvısı (bos) kan yok kirlenme ile bol topluluğu için geliştirilmiş bir teknik anlatılmaktadır. Daha fazla örnek toplama ve saflık ile daha fazla analiz anlayışımız beyin ve omurilik etkileyen hastalıkların daha fazla için CSF kullanarak gerçekleştirilebilir.
Bu prosedürün genel amacı, kandan kontaminasyon olmadan farelerden beyin omurilik sıvısının toplanmasını iyileştirmektir. Bu yöntem, nöral hastalıkların biyobelirteçlerini izlemek için BOS toplamanın kolay ve güvenilir bir yolunu sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, farelerden BOS toplanmasına yardımcı olmak için mikromanipülatör ile ilavenin, toplama sırasında kanın kirlenmesini azaltmasıdır.
Bir mikromanipülatöre sıkıca monte edilmiş bir kılcal tutucuya çekilmiş bir cam kılcal yerleştirerek başlayın. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu ile bakarken, keskinleştirilmiş kılcal damarın ucunu kırmak için düz forseps kullanın, böylece kırık ucun iç çapı yaklaşık 10 ila 20 mikron olur. Daha sonra kılcal tutucunun diğer ucuna ince bir tüp ve bir şırınga takın, ince tüpü ve şırıngayı üç bir vana ile bağlayın ve üç vanayı açmak için kaydırın.
Ardından, herhangi bir kirletici maddeyi dışarı atmak ve kılcal boruda pozitif basınç oluşturmak için şırıngayı daldırın. Şırıngayı üç vanaya ayırıp yeniden bağlayarak bunu birkaç kez tekrarlayın. Ardından, şırınganın üç valf ile son yeniden bağlanmasından önce 100 ila 200 mikrolitreye kadar hava çekin.
Cerrahi işlem sırasında hasarı önlemek için mikromanipülatörü cam kılcal damar ile yana doğru hareket ettirin. Ameliyata başlamadan önce, dört uzvu da sıkıştırarak ve bir reaksiyon olmadığını gözlemleyerek farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olun. Ardından, farenin başının arkasındaki saçları, gözlerin üstünden, kulakların arasından boynun altına kadar kesmek ve kesmek için diseksiyon makası kullanın.
Stereotaksik çerçeve fare adaptörü kullanarak farenin başını sabitleyin. Farenin başını nazikçe aşağı doğru iterek başın hareket etmediğinden ve adaptöre sıkıca sabitlendiğinden emin olun. Fare derisini boynun arkasından ve ardından kafatasının ortasından farenin kulakları ve gözleri arasından kesmek için makas ve kavisli forseps kullanın.
Cildi ve dokuyu birbirinden ayırın ve cisterna magna üzerindeki alandan dışarı çekin. Diseksiyon mikroskobu ile bakarken, forseps kullanarak kafatasının tabanı üzerindeki son ince kas katmanlarını dikkatlice inceleyin ve bu kas katmanlarını ilgilenilen alanın dışına ve yana doğru hareket ettirin. Cisterna magna üzerindeki dura açığa çıktığında, zarı temizlemek için ıslak bir pamuklu çubuk kullanın ve ardından alanı kurutmak için kuru bir pamuklu çubuk kullanın.
Cisterna magna, bölgeden geçen bir ila iki büyük kan damarı ile üçgen şeklinde görünür. Kan damarlarının her iki tarafı veya arası, kılcal damar yerleştirme ve BOS toplama için idealdir. Cisterna magna açığa çıktığında, cam kılcal damarı fare kafasının arkasına hizalamak için mikromanipülatörü kullanın, böylece keskinleştirilmiş nokta 30 ila 45 derecelik bir açıyla zarın hemen arkasında olur.
Ardından, şırıngayı bir veya birkaç kez daldırın ve ardından kirletici madde olmadığından ve cam kılcal damarda negatif basınç olduğundan emin olmak için pistonu 100 ila 200 mikrolitre geri hareket ettirin. Daha sonra kılcal ucu, direnç görülene kadar, ancak zarı delmeden zara yaklaştırın. Kılcal boruyu zardan nazikçe geçirmek için mikromanipülatör kontrollerini vurun.
Açıklık delindikten sonra BOS otomatik olarak kılcal boruya çekilmelidir. BOS'u yavaşça toplamak için kılcal damarı yerinde bırakın. BOS akışı durduysa, kılcal damarda daha fazla negatif basınç oluşturmak için şırıngayı yavaşça yaklaşık 50 mikrolitre yukarı çekin.
10 ila 30 dakika içinde on ila 15 mikrolitre BOS toplanır. İstenilen hacimde BOS toplandıktan sonra, boruya bağlı şırıngayı kapatmak ve çıkarmak için üç vanayı kaydırarak boruyu kapatın. Kılcal damarda, boruda ve kılcal damarın dışındaki alanda eşit basınç oluşturmak için boruyu açın ve ardından kapatın.
Ardından, mikromanipülatör kullanarak cam kılcal damarı fareden nazikçe çıkarmadan önce şırıngayı yeniden bağlayın. Ardından, bir mikrolitre 20X proteaz inhibitörü içeren toplama tüpünü cam kılcal damarın keskinleştirilmiş noktasının altına yerleştirin. Hortumu açın ve şırıngayı yavaşça daldırın.
BOS kılcal damardan dışarı ve toplama tüpüne akmalıdır. Toplama işleminden sonra, numuneyi toplama tüpünün altındaki proteaz inhibitörü ile karıştırmak için BOS'u darbeli santrifüjleyin. BOS numuneleri ayrıştırılabilir ve daha sonra eksi 80 santigrat derecede daha fazla analiz için saklanabilir.
APP / PS1 farelerinden toplanan BOS, 12 aylıkken insan A beta 42 seviyelerinde önemli bir artış gösterdi. Yabani tip farelerde, insan A beta 42 tespit edilmedi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür uygun şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, kılcal damarları yerleştirirken kan damarlarından kaçınmayı ve kanla kontaminasyonu önlemek için BOS toplama sırasında mikromanipülatör ile sadece küçük ayarlamalar yapmayı unutmamak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, farelerden minimum kan kontaminasyonu ile beyin omurilik sıvısı (BOS) toplamak için geliştirilmiş bir yöntemi özetlemektedir. Bir mikromanipülatör kullanan bu teknik, örnek saflığını ve hacmini artırarak nöral hastalıklardaki biyobelirteçlerin daha iyi analiz edilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Serebrospinal sıvı analizi
- Nörolojik hastalık araştırmaları
Arka Plan
- BOS, beyin ve omuriliği etkileyen hastalıkların anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Toplama sırasında kan bulaşması, araştırma bulgularını tehlikeye atabilir.
- Geliştirilmiş toplama yöntemleri, biyobelirteç analizleri için örnek bütünlüğünü artırabilir.
- Bu teknik, nörodejeneratif durumların incelenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Farelerden BOS toplamak için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Toplama işlemi sırasında kan kontaminasyonunu minimize etmek.
- Nöral hastalık biyobelirteçlerinin daha doğru izlenmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Yöntem, cisterna magna'dan hassas CSF toplama işlemi için cam kılcal borulu bir mikromanipülatör kullanır.
- Fareler uygun şekilde anesteziye alınır ve kılcal borunun yerleştirilmesi için cisterna magna'yı açığa çıkarmak amacıyla cerrahi teknikler uygulanır.
- Herhangi bir multiomik iş akışına atıfta bulunulmamıştır; odak noktası CSF toplamadır.
- Prosedür, deneyimle birlikte yaklaşık bir saatte tamamlanabilir.
- Koruma amacıyla, CSF toplama işleminden sonra bir proteaz inhibitörü ile karıştırılır.
Ana Sonuçlar
- Bu teknikle 10 ila 30 dakika içerisinde 10 ila 15 µL BOS toplanabilmektedir.
- APP/PS1 farelerinden toplanan BOS, 12. ayda insan A beta 42 seviyelerinde anlamlı bir artış göstermiştir.
- Yabani tip fare örneklerinde A beta 42 tespit edilmemiştir.
- Prosedürün verimliliği ve kan kontaminasyonunu önleme yeteneği başarıyla kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, kontaminasyonu minimize ederek farelerden BOS elde etmek için etkili bir yöntem sunmaktadır.
- Toplanan BOS'un artırılmış saflığı ve hacmi, nöral hastalık araştırmalarındaki biyobelirteç analizlerini iyileştirebilir.
- Bu yöntem, nörolojik bozukluklarda beyin omurilik sıvısı dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Güvenilir beyin omurilik sıvısı (BOS) toplanması, numune saflığının veri kalitesini ve hedef doğrulama güvenini doğrudan etkilediği nörodejeneratif hastalık araştırmalarındaki biyobelirteç keşfi için temel teşkil eder. Bu yöntem, daha yüksek verimli ve düşük kontaminasyonlu BOS ekstraksiyonuna olanak tanıyarak fare nörobilim iş akışlarındaki kritik bir darboğazı giderir ve terapötik hipotezlerin daha sağlam mekanistik risk analizlerini destekler. İyileştirilmiş BOS erişilebilirliği, hedef belirlemeden preklinik biyobelirteç izlemeye kadar olan translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarmasötik Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Mekanistik belirsizliğin azaltıldığı, hastalıkla ilişkili bir sistemde biyobelirteç analizi yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşiminin ve yolak modülasyonunun boylamsal izlemi için BOS'a tekrarlanabilir erişim sağlar.
- Öngörücü Değer: Hedefle ilişkili moleküler değişikliklere olan güveni artırarak biyobelirteç tabanlı devam/dur kararlarını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kantitatif biyobelirteç analizleri için uygun, saflaştırılmış CSF örnekleri sağlayarak tarama güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Örnek hazırlama sürecini standardize ederek sonraki analitik iş akışlarındaki değişkenliği azaltır.
- Ölçeklenebilirlik: Kohortlar genelinde tutarlı CSF toplanmasına olanak tanıyarak analiz validasyonunu ve tekrarlanabilirliğini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar, hastalıkla ilişkili modeller kullanılarak biyobelirteç uyumunu destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: APP/PS1 farelerinde insan A beta 42 gibi hedef biyobelirteçlerin izlenmesine olanak tanıyarak öngörüsel güveni artırır.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Nöral hastalık modellerindeki saptanabilir biyobelirteç değişikliklerine dayalı, veri odaklı ilerleme kararlarına imkan sağlar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, biyobelirteç analizi için güvenilir bir öncül örnek kaynağı sağlayarak hedef doğrulama ve öncü bileşik optimizasyon aşıları arasında köprü kurmakta ve böylece erken keşif iş akışlarına entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: BOS'taki biyobelirteç ölçümleri aracılığıyla hipotez testlerini ve yolak aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için tutarlı hacim ve saflıkta, analize hazır örnek üretimini sağlar.
- Analitik: Farklı durumlar arasında karşılaştırmalı analizi kolaylaştıran kantitatif biyobelirteç okumaları (örn. insan A beta 42) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: BOS biyobelirteç dinamiklerini, genetik modellerdeki preklinik hastalık ilerlemesiyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Nörobilim keşif programları genelinde BOS toplama işlemi için standartlaştırılmış, yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Daha temiz ve daha yüksek hacimli biyobelirteç verileri aracılığıyla hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar ve çalışmalar arasında BOS toplamanın tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu geliştirir.
- Stratejik Değer: Kontamine olmuş veya yetersiz numuneler nedeniyle başarısız olan deneyleri azaltarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Preklinik modellerdeki güvenilir biyobelirteç dalgalanmalarına dayanarak hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Hassas kapiller konumlandırma için mikrocerrahi ve mikromanipülatör kullanımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- Diseksiyon mikroskobuna, stereotaksik çerçeveye ve sıvı taşıma ekipmanlarına bağımlıdır.
- Tekrarlanabilirliği sağlamak için cerrahi ve toplama protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Diğer modellere adaptasyon, cisterna magna erişilebilirliğindeki farklılıklar nedeniyle anatomik düzenlemeler gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında operatör becerisine bağımlılık ve CSF verimindeki potansiyel fizyolojik değişkenlik yer alır.
