Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Bu yöntem biyomedikal araştırma alanında biyomarker keşfi, ilaç keşfi, teşhis ve ilaç veya antikor ların taranması gibi anahtar soruların yanıtlatılabiliyor. Bu tekniğin en büyük avantajı yüksek verimli olması ve protein izoformlarını son derece tekrarlanabilir bir şekilde tespit edebildiğidir. Etkilenen proteinleri veya izoformlarını ölçebildiği için bu tekniğin etkileri birçok hastalığın tanısına kadar uzanır.

Bu yöntem hücre sinyalyolları hakkında bilgi sağlasa da, spesifik proteinlerin analiz edilmesi gereken diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, kabarcıkların kaldırılması, plakanın yüklenmesi vesaire gibi hileler nedeniyle öğrenmenin zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. İlk olarak, bir mikrolitre DMSO inhibitörü karışımı ve iki mikrolitre proteaz inhibitörünün 47 mikrolitre numune seyrelticisine ekleyerek bir örnek seyreltici karışımı hazırlayın, böylece DMSO ve proteaz inhibitörlerinin son konsantrasyonu bir X.Dilute daha önce izole edilmiş protein lisatları kullanarak istenilen konsantrasyonları elde etmek için.

Sonra, standart merdiven 3.325 mikrolitre ekleyin, proteaz inhibitörü altı mikrolitre, ve antholite premix 137.675 mikrolitre DMSO inhibitörü üç mikrolitre. En az 15 saniye lik numuneyi girve buzda tut. DMSO proteaz inhibitörlerinin ve izoelektrik nokta standart merdivenin son konsantrasyonlarının bir X olması ve kılcal damardaki proteinlerin istenilen son konsantrasyonlara ulaşması için hazırlanan iki çözeltiyi bir veya üç oranında karıştırın.

Proteinler örnek karışıma eklendikten sonra, tüm adımlar buzda veya dört santigrat derecede gerçekleştirilir. Buz üzerine 384 kuyuluk bir tabak yerleştirin. Otomatik Batı lekeleme sistemi yazılımı ile tasarlanan test şablonu düzenine göre, numune karışımının on mikrolitresini plakanın uygun kuyuya yükleyin.

Bunu takiben, antikor dilüent ile primer ve sekonder antikorları seyreltin. Daha sonra, pipet her kuyuya 10 mikrolitre primer antikor ve 15 mikrolitre ikincil antikor. Sonra, luminol ve peroksit XDR bir oran bir karıştırın.

Pipet 15 mikrolitre luminol peroksit her kuyuya karışır. Numuneler ve reagantlar tabağa eklendikten sonra, 2500 kez G'de on dakika santrifüj ve sıvıyı aşağı döndürmek ve kabarcıkları çıkarmak için dört santigrat derece. Kabarcıklar hala varsa, ince bir pipet ucu kullanarak el ile kaldırın.

Otomatik Western blotting sistem yazılımını açın ve dosya menüsünden new''yi tıklatın. Düzen bölmesine gidin ve 384 kuyuluk plakadaki reagant'lar ve numuneler için konumlar atayın. Bloğun herhangi bir yerindeki bir kuyuyu tıklatarak bir reagant ataması yapın.

Her biri 12 kuyudan oluşan bir satır bloğu seçin. Ardından, düzen bölmesi araç çubuğuna gidin ve bir örnek, birincil, ikincil veya luminol satır bloğu ekleyin. Protokol bölmesine gidin ve plakada bir reagant konumu seçin.

Ardından, örnek sütundaki hücreyi tıklatın ve açılır menüden reagant'ı seçin. Aynı şekilde, her döngü için birincil, ikincil ve luminol için reagant konumlarını seçin. Birincil veya ikincil antikor sütununda hücreleri teker teker tıklatın ve gerekirse kuluçka sürelerini değiştirin.

Ardından, protokol bölümündeki Ekle düğmesini tıklatarak döngüler ekleyin. Şablon bölmesine, birincil ve ikincil antikorların kimliği, katalog numaraları ve seyreltmeleri gibi örnekle ilgili bilgileri girin. Yeni bir ait sonuç dosyasını kaydedin.

Başlat düğmesini tıklatmadan önce, her şeyin doğru olduğundan emin olmak için düzeni hızlıca kontrol edin. Şimdi, çalıştırmaya başlamak için başlat'ı tıklatın. Yazılım, kullanıcıdan atıkları temizlemesini, su ve kılcal kutuyu doldurmasını, kaynak tepsisine anolit ve katolit eklemesini, yıkama tamponu eklemesini ve plakayı soğutulmuş numune tepsisine yüklemesini ister.

Çalışma başladıktan birkaç dakika sonra bilgisayar ekranında bir enstrüman durum çubuğu görüntülenir. Durum ve ayırma bölmelerini görmek için çalıştır özeti'nin ekranına tıklayın. Bir kılcal damarda elektroforez in ayrımını gözlemlemek için, istenilen döngüyü tıklayıp kontrol panelindeki oynat düğmesine tıklayarak o kılcal damar için ayırma filmini oynayın.

Çalıştır dosyasını açın ve çözümleme ekranı sekmesini seçin. Izoelektrik nokta aralığını değiştirmek için edit've ardından analiz'e tıklayın. Uygun izoelektrik nokta standardını uygulayın.

Bir tepe sığdırma ekleyin ve bir tepe adı ekleyin. Son olarak, zirveler sekmesinde kullanılacak verileri seçin ve daha fazla analiz için verileri dışa aktarın. Vasküler endotelyal büyüme faktörü uyarılmış lysates fosforilted ekstrasellüler sinyal-regüle kinazelektroferogramı burada gösterilmiştir.

Vasküler endotelyal büyüme faktörü ile gözlenen fosforitane proteinlerin çok yüksek indüksiyonu vardır. Inset endojen yükleme kontrolü gösterir, HSP 70, hem işlenmemiş ve tedavi örnekleri için örneklerin benzer yükleme gösteren. Konvansiyonel bir immünoblotta, fosforiile hücre dışı sinyal leregüle kiyaz proteinleri kapiller izoelektrik odaklama analizi ile dört tepeye ayrılmıştıne rağmen sadece iki bant saptamıştır.

Vasküler endotelyal büyüme faktörü uyarılmış lysates gelen ekstrasellüler sinyal regüle kinazelektroferogramı burada gösterilmiştir. Inset paralel olarak kullanılan aynı yükleme denetimini gösterir. Konvansiyonel bir immünoblot sadece iki bant ekstrasellüler sinyal-regüle kizaz bir ve ekstrasellüler sinyal-regüle kiaz iki karşılık gösterir.

Kapiller izoelektrik odaklama ile ise, hücre dışı sinyal-regüle kinaaz proteinleri dört farklı fosforilted zirveleri ve iki un-fosforile peaks karşılık gelen altı zirveleri olarak çözüldü. Bir kez hakim, bu teknik birkaç saat içinde yapılabilir, döngülerin sayısına bağlı olarak, düzgün yapılırsa. Bu prosedürü çalışırken, konvansiyonel immünoblots ile karşılaştırıldığında daha yüksek antikor konsantrasyonları kullanmayı unutmayın önemlidir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, kabarcıkların kaldırılması, plakanın yüklenmesi vesaire gibi hileler nedeniyle öğrenmenin zor olduğu için önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, proteininizin farklı izoformlarını gözlemlemek için verileri nasıl tasarlayacağınızı, numuneleri nasıl hazırlayacağınızı, testetmeyi nasıl çalıştırabileceğinizi iyi anlamalısınız.