Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, karmaşık bir karışım içerisinde ilgili proteinleri için sürgat (vekil) görevi gören peptidlerin izole edilmesi ve miktarının belirlenmesidir. İlk olarak, karışım içindeki büyük proteinler, tripsin gibi bir enzim kullanılarak bileşen peptidlere sindirilir. Ardından, hedeflenen peptid analitler ve eklenmiş kararlı izotopla işaretli bir iç standart, izolasyonun ardından protein G kaplı manyetik partiküller üzerine immobilize edilmiş anti-peptid antikorları kullanılarak zenginleştirilir.

Hedeflenen peptitler manyetik parçacıklardan ayrıştırılır ve internal standarta göre nicel analiz için kütle spektrometrisi ile analiz edilir. Bu tekniğin, geleneksel immünolojik analizler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, çok sayıda analiz oluşturmada daha hızlı ve daha maliyet etkin olmasıdır. Yüksek bir başarı oranına sahiptir ve aşağıda açıklanacak prosedürün göstereceği üzere kolayca çoklanabilir (multiplexing).

Laboratuvardaki bir teknisyen, buz üzerinde 10 µL plazma alıkoymuştur. Örneği 1000 µL derin kuyucuklu plakaya aktarın ve proteinleri denatüre etmek için parafilm ile kapatın; her örneğe 20 µL taze 9 M urea ve 30 mM DTT ekleyip 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Ardından her örneğe 3 µL taze 500 mM iodoacetamide ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Şimdi urea konsantrasyonunu 100 mM tris pH 8 ile 0.6 M'ye seyreltin ve 1:50 enzim-substrat oranı için 10 µL 1 µg/µL tripsin stok çözeltisi ekleyin.

Reaksiyonu, nihai konsantrasyonu %1 olacak şekilde üç µL saf formik asit ile birlikte 37 °C'de gece boyunca inkübe ettikten sonra, stabil izotop standardını veya birden fazla standardı eklemeye devam edin. Multiplex bir analiz gerçekleştiriliyorsa, Oasis kartuş plakasını 80% asetonitril içinde 0.1% formik asit içeren 500 µL çözelti ile iyice yıkayın ve süzüntüyü atın. Ardından, kartuş plakasına suda 0.1% formik asit içeren 500 µL ekleyerek plakayı dengeleyin ve süzüntüyü atın.

Sindirilen örnekleri kartuş plakasına yükleyin ve akışın çok yavaş olması için vakumu ayarlayın. Su içindeki %0,1 formik asidin 500 mikrolitresi ile üç kez yıkayın ve akışla gelen sıvıyı atın; ardından %80 asetonitril içindeki %0,1 formik asidin 500 mikrolitresi ile peptidleri iki kez elüe edin, ardından elüatı liyofilize ederek veya hızlandırılmış vakumla kurutun ve kurutulmuş peptidleri 50 mikrolitre PBS artı %0,03 Chaps içinde yeniden çözün. Örnekleri standart bir Kingfisher 96 kuyucuklu plağa aktarın; hedef başına bir mikrogram antikor ve 1,5 mikrolitre Protein G kaplı manyetik boncuk ekleyin. Boncukları eklemeden önce vorteksleyin.

Boncukların iyi şekilde süspande olduğundan emin olmak için plakayı folyo ile kapatın ve hafif devirli bir döner santrifüjde gece boyunca inkübe edin. Folyo yüzeyindeki sıvıyı uzaklaştırmak için plakayı 400 RPM hızında 10 saniye boyunca santrifüjleyin.

Folyo kapağı çıkarın. Numune manipülasyonu, otomatik bir Kingfisher platformunda gerçekleştirilir. Boncukları iki kez 200 µL PBS artı %0,03 CHAPS ile ve bir kez 200 µL 1:10 oranında seyreltilmiş PBS artı %0,03 CHAPS ile yıkayın; ardından peptitleri 25 µL %5 asetik asit artı %0,03 CHAPS ile elüe edin.

Elüsyon plakasını bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve kalan boncukları aktarmamaya dikkat ederek elüatı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Plakayı tavan matı ile kapatın ve elüat içeren bu plakayı analiz için üçlü veya dörtlü kütle spektrometresine iletin. MRM yöntemi, ilgilenilen peptidin tandem kütle spektrumu elde edilip ardından en iyi geçiş fragman iyonlarının seçilmesi ve optimize edilmesiyle oluşturulur.

Genellikle, MRM analizi için konfigürasyonda iki mobil faz ile birlikte C 18 trap ve analitik kolonlar kullanılır. Numunenin 10 µL'sini yükleyin ve lineer gradyan ile elüye edin. Hafif ve ağır peptitler için pik alanlarını entegre edin ve her numunedeki işaretlenmemiş peptit ile işaretlenmiş peptitin pik alanı oranını hesaplayın.

Hafif ve ağır peptitler aynı anda elüe olur ve her bir peptit için birden fazla geçiş izlenebilir. Kimliği doğrulamak için, hedef peptidin kantitatif bir ölçümünü sağlamak amacıyla endojen peptidin pik alanı, iç standardın alanına oranla ölçülür. Bu videoyu izledikten sonra, bu tekniği laboratuvarınızda nasıl uygulayacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İlgi duyulan herhangi bir proteinin miktarını belirlemek için kullanılabilir, bu da onu biyolojik araştırmalarda geniş bir uygulama alanı için uygun hale getirir.