Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı
13 Nisan 2018
Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.
Bu protokolün genel amacı, karmaşık karyotiplere sahip hücre döngüsü tutuklanmış hücreleri oluşturmak ve izole etmek için basit bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, bağışıklık sisteminin anöploid hücrelerle etkileşimi gibi anöploidi araştırmaları alanındaki temel sorulara cevaplar sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yalnızca karmaşık karyotipleri barındıran bir hücre popülasyonu oluşturmasıdır.
RPE-1 hTERT hücrelerinin senkronizasyonuna başlamak için, taze çözülmüş hücreleri kullanın ve bunları sekiz mililitre standart büyüme ortamı kullanarak 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına dağıtın. Ardından, hücre numarasını belirlemek için bir hemositometre kullanın. Ardından, hücreleri gece boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, standart büyüme ortamını beş milimolar timidin içeren ortamla değiştirin. G1S sınırındaki hücreleri senkronize etmek için 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
Daha sonra, yıkanmış hücrelere standart büyüme ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin. İlk olarak, hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, 500 nanomolar Mps1 İnhibitörü reversin içeren ortamı ekleyin.
37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, standart büyüme ortamı ekleyin ve plakaları inkübatöre geri koyun.
İlk anormal mitozdan yaklaşık 72 saat sonra, hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, 330 nanomolar nokodazol içeren ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin.
Ertesi gün, nokodazol ortamını aspire edin. Daha sonra tabağa üç mililitre PBS ekleyin ve mitotik hücreleri sallamak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun. Mitotik hücrelerin eşit şekilde çıkarılmasını sağlamak için plakayı her musluk arasında döndürün.
İlk çalkalamadan sonra, plakanın kapağına ve kenarına yapışan sıvıyı aspire edin. Ardından, plakayı mikroskop altında 10X büyütmede kontrol edin. Sonra hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra, 330 nanomolar nokodazol içeren ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Son çalkalamadan sonra, 10 mililitre standart büyüme ortamı ekleyin.
Tahlilleri gerçekleştirmeden önce hücreleri 37 santigrat derecede 12 ila 24 saat inkübe edin. Plaka üzerinde kalan hücreler, kompleks karyotip veya ArCK hücreleri ile tutuklanmış olarak adlandırılır. Bu protokol, ArCK hücrelerini izole etmek için basit bir yöntemi tanımlar ve izolasyonlarını doğrulamak için ArCK hücrelerine özgü çeşitli özellikler analiz edilir.
ArCK hücreleri, immünoblot analizinde artmış hücre döngüsü inhibitörleri p53, p21 ve p16 seviyeleri gösterirken, öploid ve anöploid döngü hücreleri göstermez. Ek olarak, ArCK hücreleri, öploid kontrol hücreleri değilken mavi-yeşile boyanan yaşlanma ile ilişkili beta-Galaktosidaz için pozitiftir. Segmentasyon grafikleri, ArCK hücrelerinin çoklu, rastgele kromozom kazanımları ve kromozom kayıpları ile karakterize edilen anöploid olduğunu ortaya koymaktadır.
Segmentasyon grafikleri, bir euploid referans log iki ölçeğine göre, kromozom birden X'e kadar tek hücrelerin kopya sayısını gösterir. Bu prosedürü denerken, her sallama sırasında tüm mitotik hücreleri çıkardığınızdan emin olmak önemlidir. Bu işlem yapıldıktan sonra sitokin tahlilleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Bu tahliller, ArCK hücrelerinin bağışıklık sistemi hücreleri ile etkileşime girme yeteneği gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Nokodazolün tehlikeli olduğunu unutmayın. Bu reaktifi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik ArCK hücrelerini in vitro olarak verimli bir şekilde izole etmek için kullanılabilir. Bu prosedür uygun şekilde yapılırsa yedi gün içinde yapılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, hücre döngüsünde duraksamış, kompleks karyotiplere sahip aneuploid hücrelerin izole edilmesi için basit bir yöntem sunmaktadır. Teknik, aneuploidinin ve bunun hücresel davranışlar ile immün etkileşimler üzerindeki etkilerinin anlaşılmasını geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Genetik
- Nörobilim
Arka Plan
- Aneuploidi, genom instabilitesi ile ilişkilidir.
- Kompleks karyotiplere sahip hücreler genellikle bölünmeyi durdurur.
- Bu hücrelerin anlaşılması, kanser ve diğer hastalıklar hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Bu hücrelerin izole edilmesi, özelliklerine yönelik daha ileri araştırmaları kolaylaştırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre döngüsü durdurulmuş hücrelerin üretilmesi ve izole edilmesi için bir yöntem geliştirmek.
- Aneuploid hücrelerin özelliklerini araştırmak.
- Aneuploid hücreler ile bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimi incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Timidin ve nocodazol kullanılarak RPE-1 hTERT hücrelerinin senkronizasyonu.
- Mitotik hücreleri izole etmek için hücre sallama (shake-off) tekniği.
- Hücre döngüsü inhibitörlerini değerlendirmek için immunoblot analizi.
- ArCK hücrelerinin tanımlanması için yaşlanma ile ilişkili beta-Galaktosidaz boyaması.
Ana Sonuçlar
- ArCK hücreleri, artmış hücre döngüsü inhibitörü seviyeleri sergilemektedir.
- Bu hücreler, senesansle ilişkili belirteçler açısından pozitiftir.
- Segmentasyon grafikleri, izole edilen hücrelerde aneuploidiyi doğrulamaktadır.
- Yöntem, kompleks karyotiplere sahip hücreleri etkili bir şekilde izole eder.
Sonuçlar
- Protokol, aneuploid hücreleri incelemek için güvenilir bir yol sunmaktadır.
- İzole edilen ArCK hücreleri, immün etkileşimler üzerine yapılacak ileri araştırmalar için kullanılabilir.
- Yöntemin doğru şekilde uygulanması, bir hafta içinde sonuç alınmasını sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Karmaşık karyotiplere sahip hücre döngüsü durdurulmuş hücrelerin izole edilmesi, keşif biyolojisinde anöploidi kaynaklı fenotiplerin mekanistik risk analizinin yapılmasını sağlar. Bu yaklaşım, kromozomal instabiliteyi ve bunun hücresel yaşlanma, inflamasyon ve immün etkileşimler üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir bir sistem sunarak hedef doğrulamayı destekler. Yöntemin standart doku kültürü tekniklerine dayanması, erken aşama Ar-Ge süreçlerinde ölçeklenebilirliği ve fonksiyonlar arası adaptasyonu artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Validasyonu
- Bilimsel Değer: Aneuploidiyi genom instabilitesi ve pro-inflamatuar fenotiplerle ilişkilendiren terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Timidin, reversin ve nocodazol senkronizasyonu kullanarak ArCK hücreleri üretmek için standartlaştırılmış, düşük maliyetli bir iş akışı sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Senesans belirteçlerinin ve sitokin salınımının kantitatif analizi için kompleks karyotiplere sahip tanımlı bir hücre popülasyonu oluşturur.
- Operasyonel Değer: Çalkalama ile ayırma ve nocodazole uygulaması yoluyla duraklamış hücrelerin tutarlı izolasyonu sayesinde analiz standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Aneuploid hücrelerin bağışıklık hücreleri ile etkileşimlerinin incelenmesini kolaylaştırarak immünomodülatör hedef değerlendirmesine bilgi sağlar.
- Operasyonel Değer: Fenotipik çıktıları doğrulamak için sitokin profilleme ve senesansla ilişkili beta-Galaktosidaz boyaması gibi downstream fonksiyonel analizlara olanak tanır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, özellikle kromozomal instabilite ve stres yanıt yolaklarını içeren mekanizmalar için, hedef hipotez testinden fenotipik taramaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Aneuploidi ile hücresel fenotipler arasındaki nedensel bağlantıları açıklığa kavuşturmak için belirlenmiş karyotipik karmaşıklığa sahip hücreleri izole ederek mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler.
- Tarama: Hücre döngüsü inhibitörlerinin ve sekresyon profillerinin yüksek içerikli analizi için ArCK hücrelerinin tekrarlanabilir şekilde hazırlanmasına olanak tanır.
- Analitikler: p53, p21, p16'nın immunoblot tespiti ve tek hücreli kopya sayısı varyasyonu için segmentasyon grafikleri dahil olmak üzere kantitatif çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Bağışıklık etkileşimi çalışmalarıyla bağlantı kurarak, yaşlanma ile ilişkili sekresyon fenotiplerinde biyobelirteç araştırmalarını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Erişilebilir reaktifler ve standart kültür ekipmanları kullanarak, özel altyapı gerektirmeden farklı laboratuvarlarda adaptasyona imkan tanır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kompleks karyotiplere sahip tanımlanmış bir durdurma modeli sağlayarak, aneuploidi araştırmalarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: ArCK hücreleri için yüksek özgüllüğe sahip yedi günlük bir protokol sunarak işlem hacmini ve tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Hedef yollardaki aneuploidi kaynaklı biyolojik risklerin erken değerlendirilmesine olanak tanıyarak devam/durdur kararlarına bilgi sağlar.
- Portföy Etkisi: Kromozomal instabilite ve senesans ile bağlantılı hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Hücre senkronizasyon teknikleri ve mitotik shake-off prosedürleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Doğrulama için standart doku kültürü inkübatörlerine, hemositometrelere ve floresan veya parlak alan mikroskopisine erişime bağlıdır.
- Tekrarlar arasında mitotik hücrelerin tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için nocodazole kullanımı ve yıkama adımlarının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer hücre hatlarına uyarlama; timidin, reversin ve nocodazole konsantrasyonlarının ve zamanlamalarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- In vitro modellerle sınırlıdır; primer doku veya in vivo uygulanabilirliği kaynak materyalde ele alınmamıştır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
