Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

Bu protokolün genel amacı, multipl skleroz gibi otoimmün bozuklukların tedavisinde immünoterapötik faydalarının değerlendirilmesi için murin tolerojenik dendritik hücreleri geliştirmek ve karakterize etmektir. Bu yöntem, tolerojenik dendritik hücrelerin geliştirilmesi ve işlevsel olarak karakterize edilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sağlayarak tolerojenik dendritik hücre tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, başarılı tolerojenik dendritik hücre gelişimi ve fonksiyonel tolerojenik dendritik hücre etkinliği testi için kullanılabilmesidir.

Bu tekniğin sonuçları önemlidir. Tolerojenik dendritik hücreler, içsel immün düzenleyici mekanizmalara tabi kalırken anormal bir immün yanıtı sıfırlayabildiğinden, otoimmün bozukluklar için hücresel immünoterapinin geliştirilmesine doğru uzanırlar. Sekiz ila 10 haftalık C57BL / 6 farelerinden arka bacak kemiklerini topladıktan sonra, standart protokollere göre, mümkün olduğunca fazla dokuyu incelemek için cerrahi bıçaklar ve forseps kullanın ve temiz tibiaları ve femurları altı santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin% 70 etanol

Kemiklerin her iki ucunu da cerrahi bir bıçakla kesin ve iliği ilk kemikten üç mililitre PBS ile 15 mililitrelik konik bir tüpe akıtmak için 23 gauge iğne ile donatılmış üç mililitrelik bir şırınga kullanın. İliğin tamamı toplandığında, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve peleti bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Beş dakika sonra, lizizi dokuz mililitre PBS ile durdurun ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Beyaz kemik iliği hücresi peletini 10 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden yeni bir tüpe süzün. Hücreleri, GM-CSF ve IL-4 ile desteklenmiş kültür ortamında mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila altıncı hücreye ayarlayın. Ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte üç günlük bir inkübasyon için 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna üç mililitre hücre yerleştirin.

Üçüncü gün, her bir kuyucuktaki hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için hafifçe döndürün. Daha sonra hücreleri GM-CSF ve IL-4 ile takviye edilmiş üç mililitre taze kültür ortamı ile besleyin ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun, iki gün sonra her bir oyuğa sitokinlerle takviye edilmiş üç mililitre daha taze kültür ortamı ekleyin. Kültürün yedinci gününde, tabağı buzun üzerine yerleştirin.

10 dakika sonra, gevşek bir şekilde yapışan, olgunlaşmamış, kemik iliği türevi dendritik hücreleri süspansiyona çıkarmak için kültür ortamını her bir oyuğa nazikçe pipetleyin. Daha sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplanmak üzere bir araya getirin ve sonraki aşağı akış analizi için peleti uygun hacimde taze kültür ortamında yeniden süspanse edin. Sinjeneik T hücresi proliferasyonunu ölçmek için, önce sekiz ila 10 haftalık bir OT2 C57BL / 6 fareden bir dalağı 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirmek için üç mililitrelik bir şırınga pistonunun arka ucunu kullanın ve süzgeci PBS ile durulayın.

Havuzlanmış hücre süspansiyonunu santrifüjleme ile pelet haline getirin ve peleti 400 mikrolitre manyetik hücre sıralama tamponu ve 100 mikrolitre CD4 pozitif T hücresi biyotin-antikor kokteyli içinde dört santigrat derecede beş dakika boyunca yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, 10 dakikalık, dört santigrat derece inkübasyon için hücrelere 300 mikrolitre ayırma tamponu ve 200 mikrolitre anti-biyotin boncuk ekleyin ve bir manyetik boncuk sütunu ve bir ön ayırma filtresi yerleştirin uygun boyutta bir hücre ayırma mıknatısına. Sütunu üç mililitre ayırma tamponu ile durulayın ve hücrelere dokuz mililitre sıralama tamponu ekleyin.

Santrifüjlemeden sonra, hücreyi ve boncuk peletini üç mililitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve CD4 pozitif T hücresi elüatını uygun bir kapta toplamak için hücre süspansiyonunu kolona ekleyin. Daha sonra sütunu üç mililitre başka bir ayırma tamponu ile yıkayın, akışı toplayın ve T hücrelerini buzun üzerine yerleştirin. Sinjeneik splenik pan dendritik hücre izolasyonu için, dalağı sekiz ila on haftalık bir C57BL / 6 fareden altı santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve bir mililitre Kollajenaz D solüsyonunu dalağa iki kez enjekte etmek için 25 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın.

Daha sonra, dalağı küçük parçalara ayırmak için makas kullanın ve parçaları oda sıcaklığında 25 dakika çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, oda sıcaklığında son beş dakikalık bir inkübasyon için doku bulamacına 500 mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin. Kuluçka işleminin sonunda, dalak bulamacını 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirmek ve hücreleri santrifüjleme ile toplamak için üç mililitrelik bir şırınga pistonunun arka ucunu kullanın.

Dört santigrat derecede 10 dakikalık bir inkübasyon için peleti 350 mikrolitre manyetik hücre sıralama tamponu, 50 mikrolitre Fc reseptör bloke edici reaktif ve 100 mikrolitre pan dendritik hücre biyotin-antikor kokteyli içinde yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri dokuz mililitre ayırma tamponunda yıkayın ve peleti, dalak pan dendritik hücre popülasyonunun manyetik boncuk sıralama ile manyetik boncuk sıralama ile izolasyonu için 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 200 mikrolitre anti-biyotin boncuk ile 800 mikrolitre taze ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri mililitre konsantrasyon başına 10 ila beşinci dendritik hücrelere iki kez yeniden süspanse edin ve bunları 37 santigrat derecede bir saat boyunca ilgilenilen triterpenoidin uygun deneysel konsantrasyonu ile tedavi edin.

İnkübasyonun son üçte biri sırasında, T hücrelerini bir mikromolar CFSE'de 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca mililitre başına 10 ila yedinci hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve hacmi mililitre başına 10 ila altıncı T hücresi olmak üzere iki kez nihai konsantrasyona yeniden ayarlayın. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 100 mikrolitre CFSE etiketli CD4 pozitif T hücresi ile tedavi edilen dendritik hücrelerin 100 mikrolitresini birlikte kültürleyin ve hücrelere mililitre başına 100 nanogram OVA peptidi 323-329 ekleyin, iki ila üç günlük inkübasyondan sonra T hücrelerinin CFSE yoğunluğunu ölçer.

GM-CSF ve IL-4 varlığında tam ortamda kültürlenen kemik iliği progenitör hücreleri, kültürde altı gün sonra olgunlaşmamış bir dendritik hücre morfolojisi sergiler. Olgunlaşmamış yedinci gün kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin analizi, kültürlenmiş hücrelerin çoğunluğu tarafından spesifik bir murin dendritik hücre belirteci olan CD11c'nin sağlam ekspresyonunu ortaya koymaktadır. LPS ile indüklenen olgunlaşma belirteçlerinin ekspresyonu üzerinde bir etki olmamasına rağmen, kemik iliği kaynaklı dendritik hücreler, pro-inflamatuar gen ekspresyonunda önemli bir azalma ve gelişmiş bir anti-inflamatuar sitokin gen ekspresyonu ile kanıtlandığı gibi, CDDO-DFPA tedavisine yanıt olarak tolerojenik bir dendritik hücre profili sergiler, LPS stimülasyonundan sonra bile.

Ek olarak, sinjeneik OVA'ya özgü T hücresi proliferasyonunda önemli bir azalma gözlenir in vitro OVA'nın CDDO-DFPA ile tedavi edilen dendritik hücreler tarafından sunulduğu in vitro ko-kültürlerde ve in vivo MOG darbeli CDDO-DFPA ile muamele edilen dendritik hücrelerin enjeksiyonundan sonra deneysel oto-immün ensefalomiyelite gecikmiş bir ilerleme ile kanıtlandığı gibi, bu hücrelerin tolerojenik fenotipini daha da doğrular. Bu tekniğe hakim olduktan sonra, deneyler uygun şekilde yapılırsa, sekiz gün içinde tolerojenik dendritik hücreler geliştirilebilir. Bu prosedürü denerken, tolerojenik dendritik hücrelerin homojen olmadığını hatırlamak önemlidir.

Hücresel fenotipleri, toleranslarının indüksiyonu için kullanılan ajanların doğasına bağlıdır. Bu prosedürü takiben, tolerojenik dendritik hücreye bağlı antijenik spesifik T hücresi enerjisi veya apoptoz veya T hücresi farklılaşma yeteneği hakkında ek soruları yanıtlamak için ayrıntılı akış sitometrik analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bilinen ajanlar kullanılarak fonksiyonel olarak aktif tolerojenik dendritik hücrelerin nasıl geliştirileceğini veya yeni maddelerin bu hücreleri indükleme yeteneğinin nasıl test edileceğini iyi anlamış olmalısınız.