Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Kemik iliğinden dendritik hücrelerin hazırlanması, bağışıklık sisteminin iki foton görüntülemesinde in vitro veya in vivo deneylerde kullanılabilecek mükemmel bir antijen sunan hücre kaynağı sağlar. Antijen sunan hücrelerin eklenmesi, canlı lenf nodu bağlamında antijene özgü hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanır. Burada, kemik iliğinin steril izolasyonunu ve olgun dendritik hücrelerin üretimi için kültür tekniklerini gösteriyoruz.

Ayrıca, dendritik hücrelerin birinci günden 11. güne kadar olan gelişimini takip ediyoruz. Bu gelişim, sabit görüntülerle ve scent technologies incus sitesi kullanılarak hazırlanan inkübatör videolarıyla betimlenmiştir. Son olarak, kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin, aynalama lenf düğümünde OT iki T hücrelerine cove antijeni sunduğunu gösteriyoruz.

Merhaba, ben California Üniversitesi'ndeki Micah Halen laboratuvarından Melanie Matthew. Hücreleriniz büyürken içeride neler olup bittiğini hiç merak ettiniz mi? Bugün?

Protokolümüzün bir parçası olarak, size sahadaki bazı enstrümanların nasıl kullanılacağını göstereceğiz. Inky saha, inkübatörünüzdeki hücre kültürü büyümesini takip etmenize olanak tanır. Bu protokolde, fareden kemik iliği kaynaklı grup hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve hazırlanacağını göstereceğiz.

Öncelikle size femur kemiklerinin nasıl çıkarılacağını ve kemik iliğinin nasıl izole edileceğini göstereceğim. İlk olarak hayvanı sabitleyin. Ardından, hayvanı %70 ethanol ile ıslatın. İlk insizyonu hayvanın orta hattı boyunca yapın.

Ardından, burada gösterdiğim gibi bacağın iç kısmından kesin. Femurun üzerindeki kas dokusunu açığa çıkarmak için kası kenara çekebilmeli ve büyük femur kemiğini diseksiyon pensetiyle kavrayabilmelisiniz. Kemiği diseksiyon pensetiyle tutarken, kemik boyunca aşağı doğru ilerleyin ve ilk kesiğinizi eklemin hemen altından yapın.

Ardından makası femur boyunca yukarı doğru hareket ettirin ve gövdeye mümkün olduğunca yakın bir kesim yapın. Özellikle femoral arteri kestiğinizde bu durum bir miktar kanamaya neden olabilir. Femuru çıkarırken, kemiğin bütünlüğünün korunması son derece önemlidir.

Burada gördüğünüz üzere, kemiğin uçları kesilmemiştir veya zarar görmemiştir. Femur çıkarıldıktan sonra, ek dokuları kırpın ve femuru PMI ortamı içeren küçük bir kaba yerleştirin. Ek dokuları temizlerken, femur kemiğinin kurumasın dikkat edin.

Bu aşamada, femur kemikleri %70 etanol içeren bir kaba aktarılmalı ve beş ila 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletilmelidir. Bu videonun amaçları doğrultusunda, işleme laboratuvar tezgahında devam edeceğiz. Ancak, deneyin bu aşamasından itibaren her şey bir doku kültürü kabinine aktarılmalıdır.

Kemikler etanolda bekletildikten sonra, kemik iliğinin uzaklaştırılması için onları steril besiyeri içeren daha büyük bir kaba aktarabilirsiniz. Artık kemik iliğini çıkarma ve yeniden süspansiyon haline getirme aşamasına geçebiliriz. Bir insülin şırıngasını steril besiyeri ile doldurun ve daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın.

Kemiği steril cımbızınızla kavrayın. Atık parçalar için küçük bir plağın üzerinde tutun ve her iki taraftaki epifizleri veya kemik uçlarını kesin. İnsülin şırınganızı kemiğin bir ucuna yerleştirin ve iliği kemikten 15 ml besiyerine doğru yıkayarak dışarı çıkarın.

Tüm iliğin dışarı atılmasına kadar kemiği bir veya iki kez daha yıkayın. İlik kemikten tamamen temizlendiğinde, kemik neredeyse tamamen beyaz görünecektir. Temizlenen kemiği atık kabına yerleştirin ve aynı işlemi diğer femur için tekrarlayın.

Bu işlem tamamlandıktan sonra, tek hücreli süspansiyon oluşturmak için yıkama işlemiyle parçalanmamış iliğe ait parçaları nazikçe dağıtın. Bu işlem, pipetleme ile 5 ila 10 dakika sürecektir. Tek hücreli süspansiyonu 50 ml'lik konik bir tüpe yerleştirin, plakayı en az üç kez 10 ml besiyeri ile yıkayın.

Her seferinde hücreleri santrifüjle çöktürün, medyumu uzaklaştırın ve parmaklarınızı tüpün dibine sıkıca ve hızlıca sürterek hücreleri yeniden süspansiyon haline getirin. Eritrositleri veya RBC'leri uzaklaştırmak için su lizi uyguluyoruz. Eritrositlerin uzaklaştırılması için bir diğer yöntem ise amonyum klorür lizi yapmaktır.

Her iki yöntem de önceki JoVE video makalelerinde açıklanmıştır. Mouse lenf düğümlerinden CD4 pozitif T-hücrelerinin Miltenyi Biotec purifikasyonu kullanılarak izolasyonu JoVE Sayı 9'da ve sıçan sitokinlerinden T-hücre büyüme faktörü hazırlanışı JoVE Sayı 10'da yer almaktadır.

RBC'lerinizi uzaklaştırdıktan sonra, artık kendinizi kültüre etmeye hazırsınız. Bu nedenle, sizi dendritik hücre kültürü süreciyle tanıştırmadan önce IncuCyte sistemini tanıtmak istiyorum. IncuCyte sistemi, hücrelerin inkübatör içindeki büyüme süreçlerini takip etmemize olanak tanır; böylece hücrelerin nasıl davrandıklarını veya beklenmedik tepkiler verip vermediklerini gözlemleyebiliriz.

Kültür hazırlandıktan sonra, uygun boyuttaki tepsiye yerleştirilir ve Incucyte alanı kapatılır. Ardından bilgisayarınızdan zaman aralığını belirleyip görüntülemek istediğiniz kuyucukları seçersiniz ve Incucyte'in sizin için veri toplamasını sağlarsınız. Bu protokoldeki videolar, dendritik hücre morfolojisi değişikliklerini in vitro olarak gösterecektir.

Bu videolar doğrudan Incus site programından dışa aktarılmıştır. Dendritik hücreler birinci günden 11. güne kadar gelişirken, büyüdükçe ve dendritik hücre fenotipini kazandıkça gerçek bir morfolojik değişim görülebilir. Lizis sonrası RBC'ler uzaklaştırılır, hücreler primer dendritik hücre besiyerinde yıkanır ve mil başına 5 milyon olacak şekilde ekilir.

Bu hücreler başlangıçta primer dendritik hücre kültür ortamında kültüre edilmeli, daha sonra 40 ng/mL IL-4 ve 100 ng/mL TNF-α ile desteklenmiş sekonder DC ortamında kültüre edilmelidir. Bu sitokinler, monosit türevli dendritik hücrelere benzeyen olgun dendritik hücrelerin gelişimine yardımcı olacaktır. Şimdi size kültürlerin gelişim sürecindeki görünümlerini ve zaman içinde nasıl sürdürüleceklerini göstereceğim.

Hücreleri ekildikten sonra, ilk besiyeri değişiminden önce dendritik hücreleri 72 saat boyunca kültürleyebilirsiniz. İşte hücreleri ekildiğiniz birinci günde tipik bir kültürünüzün nasıl görüneceği. Ve burada hücrelerin görünümü yer almaktadır.

Üçüncü günde, hücrelerin plağa yapışmaya başladığını ancak henüz klasik dendritik hücre fenotipini kazanmadıklarını görebilirsiniz. Dördüncü günde, besiyerini uzaklaştırın ve medyanın aspirasyonunun ardından 10 ml taze primer DC besiyeri ekleyin. Dördüncü günde, lenfositleri ve diğer tüm yapışmayan hücreleri uzaklaştıracağız.

Şimdi, ilk ekimden yedi gün sonra, örneklerinizi üç gün daha inkübatöre yerleştirebilirsiniz. Tipik bir kültürün görünümü şu şekildedir. Hücreleri ayırma ve yeniden ekleme vaktinin geldiğini buradan anlayabilirsiniz.

Yedinci günde, besiyeri aspire edilip ardından 300 millimolar steril EDTA eklenerek ve beş dakika inkübe edilerek dendritik hücreler plakadan uzaklaştırılır. Daha sonra plaka 45 derecelik bir açıyla tutulup EDTA çözeltisi plağın arka kısmına pipetlenerek defalarca durulanır. Tüm yapışık dendritik hücrelerin uzaklaştırıldığından emin olmak için bu işlem birkaç dakika boyunca tekrarlanır.

Hücreler 50 ml'lik konik bir tüpte toplanır ve sekonder DC medyumu ile iki kez yıkanır. Ardından hücreler yeniden süspanse edilir ve plaka başına 5 milyon hücre olacak şekilde ekilir. Yeni ekilmiş yedinci gün dendritik hücreleri hızla plakanın dibine çöker, yapışır ve yayılmaya başlar.

Zichy alanı videosunda görebileceğiniz üzere, bu video, yedinci günde yapılan ilk yeniden ekimden dokuzuncu günün başlangıcına kadar olan dendritik hücre gelişimini göstermek için iki gün boyunca inkübatörde çekilmiştir. Morfolojik olarak dendritik hücreler, ova spesifik CD4 pozitif T hücrelerine sahip OT2 farelerden saflaştırılmış T hücreleri ile birlikte kullanım için buraya 100 µg ova ve 2 µg/mL LPS eklenerek antijen pulse yöntemiyle aktive edilebilir. Farklı bir antijen kullanıyorsanız, DC'lerinize pulse yapmak için optimal antijen konsantrasyonunu kullandığınızdan emin olmanız önemlidir; burada OVA ve LPS, 20 mL'lik hacimde LPS'nin son konsantrasyonu 2 µg/mL ve OVA'nın 100 µg/mL olacak şekilde primer medyuma eklenir.

Burada, tipik bir 10. gün dendritik hücre kültürünün nasıl göründüğüne dair bir fotoğraf yer almaktadır. Bu fotoğrafta, morfolojinin bir antijen sunan hücre için oldukça tipik olduğunu görebilirsiniz. CD 11 C pozitif dendritik hücrelerin yüzdesini her zaman faks ile kontrol etmelisiniz.

Bu işlem, deneylerinizde kullanmak üzere nispeten saf bir dendritik hücre kültürüne sahip olduğunuzdan emin olmak içindir. Burada, 10. günde LPS ile işlem görmüş veya antijen yüklenmiş dendritik hücrelerin aktivasyonunu izlemek için SEN Instruments'tan inky site'ı kullanıyoruz. Bu video, LPS ile peptid eklemesinin hemen ardından başlayan 24 saatlik bir süreyi kapsamaktadır ve videoda dendritik hücrelerin daha aktif hale geldiği ve bazı belirgin morfolojik değişikliklerin oluştuğu görülmektedir.

Dendritik hücreleriniz antijen yüklemesi ile aktive edildikten sonra, 300 millimolar EDTA ile inkübasyon yaparak ve plakayı yıkayarak hücreleri tekrar toplayabilirsiniz. Şimdi hücreleri santrifüjleyerek çöktürün, fazla antijeni uzaklaştırmak için 50 mils RPMI medyası ile iki kez yıkayın ve uygun hücre takip boyası ile işaretleyin. Bu deneyde, hücreleri inguinal lenf nodunda görüntüleyeceğim.

Burada gösterilen farenin yan bölgesine dermis altına 2 ila 5 milyon dendritik hücre enjekte etmemiz gerekecek. Ardından, dendritik hücrelerin eğitim lenf düğümüne göç etmesi için 24 saat bekleyeceğiz. Bu videoda, dendritik hücreler mavi bir hücre takip boyası olan CMF two hc ile işaretlenmiştir.

Voline için antijen spesifik olan işaretli T hücreleri ile etkileşime giren dendritik hücreleri görebilirsiniz. Bu T hücreleri ccf SE ile işaretlenmiştir. Moleküler problar için C-M-T-M-R veya diğer hücre takip boyalarından herhangi birini de kullanabilirsiniz. Bu, dcs ile etkileşime giren T hücrelerinin erken aktivasyon aşamasıdır.

Antijen spesifik oldukları için, T-hücrelerinin mavi etiketli dc'lerin uzantılarına tutunduğunu görebilirsiniz. Bu, iki butonlu bir görüntüleme deneyinde fare kaynaklı kemik iliği dendritik hücrelerin hazırlanması ve kullanımını gösteren protokolümüzü sona erdiriyor. İzlediğiniz için teşekkürler ve kendi deneylerinizde başarılar dileriz.