3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

Bu yöntem, Zebra balığı embriyo dizileme prosedürünü önemli ölçüde hızlandırabilir ve Zebra Balığı'nı yüksek verimli tarama için gerçekten uygun hale getirebilir. Bu tekniğin ana avantajı, Zebra balığı embriyolarını 96 veya 384 oyuklu bir matrise önceden dizmek için 3D baskılı bir şablonun kullanılmasıdır, bu da yüksek verimli bir plaka hazırlama sürecini kolaylaştırır. Yöntem fikri ilk olarak, modüler bir plakanın her bir oyuğuna tek tek embriyoları manuel olarak seçip seçerek nanopartiküllerin taranmasını gerçekleştirirken aklımıza geldi ve verimliliği artırmak istedik.

Tianyu'ya ek olarak, diğer yüksek lisans öğrencisi Yue Jiang da prosedürü gösterecek. Bu prosedüre, standart bir 96 kuyulu plakaya uyan on ikiye sekiz 96 kuyulu bir düzene sahip dizi şablonunun tasarımıyla başlayın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi.

Şablonu yazdırmak için 0,1 milimetre hassasiyete sahip bir 3D yazıcı kullanın. Şablonun bazı temel bileşenleri, tuzak odası, tuzak kuyusu, vakum odası ve hava giriş çıkışıdır. Zebra balığı embriyo yumurtlamasını gerçekleştirmek için önce erkek ve dişileri şeffaf bir plastik bölücü ile ayırın.

Ardından, yumurtlamadan bir gün önce çiftleşme kutusuna iki çift erkek ve dişi balık yerleştirin. Yumurtlama gününde, erkek ve dişi balıkları karıştırmak için sabahları bölücüleri çıkarın. Erkek ve dişi balıkları çıkarın ve ince gözenekli bir süzgeç kullanarak Zebra balığı embriyolarını toplayın.

Embriyoları 250 mililitre yumurta suyu ile yıkayın. Toplanan embriyoları Holtfreter Solüsyonu ile Petri kaplarına aktarın. Stereo mikroskop kullanarak ölü ve döllenmemiş embriyoları çıkarın.

Embriyoları 28,5 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Döllenmeden dört saat sonra embriyoları gözlemleyin ve ölü ve sağlıksız embriyoları çıkarın. Embriyolar artık bir sonraki adım için hazırdır.

Şablonu beş dakika kurutma fırınına koymadan önce 500 mililitre deiyonize su ile iki ila üç kez yıkayın. Ardından, alt hazneyi bir parça sızdırmazlık filmi ile bantlayın. Sızdırmazlık filmi ile kapatılmış haznede negatif basınç oluşturmak için şablonun altındaki hava çıkışından bir vakum pompası bağlayın.

Plastik bir transfer pipeti kullanarak, şablona yaklaşık 150 embriyo yerleştirin. Her bir oyukta bir embriyo sıkışana kadar tüm şablonu yatay olarak sallayın. Bu adımda, mevcut her Zebra balığı embriyosunu kontrol etmek ve emin olmak çok önemlidir.

Holtfreter arabelleği çok düşükse, şablonu sallayarak ek arabellek eklenebilir. Fazladan Holtfreter Solüsyonunu ve kuyucuklarda sıkışıp kalmayan embriyoları atın. Vakum pompasını kapatın ve bağlantısını kesin.

Standart bir 96 kuyulu plakayı şablona karşı baş aşağı yerleştirin ve her ikisini de aynı anda döndürün. Sıkışan tüm embriyoları şablondan 96 oyuklu plakaya aktarmak için şablonun altına dokunun veya hava çıkışını sıkıştırılmış bir gaz toz alma kabına bağlayın. Son olarak, sızdırmazlık filmini çıkarın ve şablonu ileride kullanmak üzere 500 mililitre deiyonize su ile yukarıdan aşağıya üç kez yıkayın.

Burada, şablon tarafından dizilmiş 96 oyuklu bir plakanın kısmi görüntüsü gösterilmektedir. Tersine, bu görüntü manuel olarak dizilmiş 96 oyuklu bir plakanın kısmi görüntüsünü göstermektedir. Embriyoların manuel ve dizilim şablonu yöntemleri ile kaplandıktan sonraki genel sağlık durumu burada görüntülenir.

Embriyoların yumurtadan çıkma, sağkalım ve malformasyon oranlarına dayanarak, her iki durumda da embriyoların genel sağlığı üzerinde önemli bir etki gözlenmemiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde uygulanırsa sadece iki ila üç dakika içinde bir 96 veya 384 kuyulu plaka hazırlayacaktır. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların bu model organizmanın yeni özelliklerinden tam olarak yararlanmalarının ve in vitro yüksek verimli taramayı gerçekten başarmalarının yolunu açtı.