Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama
22 Mart 2019
Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.
X-Ray kristalografisi, proteinlerden elde edilen 3 Boyutlu yapısal bilgileri belirlemek için baskın bir tekniktir. Senkrotron ışını hatları proteinlerin ürettiği küçük, zayıf difüzif kristallerden veri elde etmek için gereklidir. Devasa olan benzersiz bir ışın hattıdır çünkü biyolojik makromoleküllerden veri toplama işlemini tam olarak otomatleştirir.
Örnek montaj, konum ve son veri toplama. Araştırmacıların ışın hattında veri toplamak yerine laboratuvarda zaman geçirmelerine olanak sağladığı için bu tür tam otomasyon çok önemlidir. Işın hattı da akıllı ve ortalama olarak, ışın hattı insanlar tarafından işletilen zaman daha iyi veri toplayabilir.
Bu protokolü başlatmak için, kristal montaj gerçekleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi Massive one üzerinde ışın süresi isteyin. Protein kristalografi ışın çizgileri veya ISPyB web sitesi için bilgi sistemine gidin. MX denemelerini seçin, deneme numarası ve parolayla giriş yapın.
Sevkiyata tıklayın, yeni ekleyin ve gerekli bilgileri sağlayın. Ardından kaydet'i tıklatın. Paket ekle'yi tıklatın ve istenen bilgileri doldurun.
Kaydet'i tıklatın, ardından kapsayıcı ekle'yi tıklatın. Disk barkod adını verin ve omurga diski seçin, tekrar kaydet'i tıklatın. Kapsayıcı sembolüne tıklayın ve edit ve diskte protein adı, tercih edilen iş akışı ve kristal konumu gibi örneklerle ilgili gerekli bilgileri doldurun.
ESRF güvenlik grubu tarafından onaylanan proteini seçin. Her bir örneği tanımlamak için benzersiz bir örnek adı girin. İsteğe bağlı olarak, pin barkod tazyik.
İçerecek bilgilerin geri kalanı da isteğe bağlıdır. Her bir örnek için deneme türünü girin. Bu, her kristali işlemek için hangi otomatik iş akışının kullanılacağını tanımlar.
GCSH kristallerinin iğne olduğu göz önüne alındığında, MX tuşuna basın P.Next'i seçin, bir uzay grubuna girin. Varsa, bu veri toplama stratejisi hesaplamaları için kullanılacak ve kullanılabilir otomatik veri işleme boru hatları tarafından. İstenilen çözünürlüğü girin.
Bu, kristalden dedektöre ilk kafes taramalarından, karakterizasyondan ve varsayılan veri toplamadan uzaklığı tanımlar. Şimdi, bu sınıra difüzif olmayan kristallerden tam veri kümelerinin toplanmasını önlemek için istenen eşik çözünürlüğünü ayarlayın. Bu, veri depolama alanından tasarruf sağlayabilir ve zamanı analiz eder.
Gerekli bütünlüğü ayarlayın. Sonra gerekli çokluğu ayarlayın. Örnek desteğinde birden fazla kristal bulunursa, analiz edilecek maksimum kristal sayısını ayarlayın.
Varsayılan değer, MX tuşuna basmak için bir veya beştir P.Uygun ışın boyutu da seçilebilir. Uzay grubuna, eğer biliniyorsa, kuvvet uzay grubu sütununa koyun. Sonra kristallerin radyasyon hassasiyetini ayarlayın.
İstenirse, tam veri kümesi koleksiyonu için toplanacak toplam dönüş açısını ayarlayın. Tüm bilgiler sisteme girdikten sonra değerleri kaydedin. Tıklayın, sevkiyatlara geri dönün ve ESRF'ye gönderi gönderme tuşuna basın.
Sevkiyat etiketini yazdırın ve örnekleri gönderin. Kullanıcılar ESRF hesap bilgilerini kullanarak bir kurye ile bir pikap düzenlemelidir. Deney günü, numuneler Massive one yüksek kapasiteli çiy-er aktarılır.
Işın hattı bilim adamları daha sonra uzaktan kullanıcılar tarafından takip edilebilir veri toplama, başlatmak. Her farklı örnek türü için, kullanıcılar veri toplamanın başladığını bildiren bir e-posta alır. Tüm iş akışlarındaki tüm adımların yürütülmesi çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilebilir.
Bu, ISPyB'e giriş yaparak kullanıcı tarafından erişilebilir. Sonuçlar da görüntülenebilir ve indirilebilir. Analiz edilen her örnek için ISPyB'deki otomatik denemenin sonuçlarını inceleyin.
ID30A1'de istenilen deneysel oturuma tıklayın. Tercih edilen otomatik işleme ardışık hattını seçin. Doğru alan grubunda yazılan verileri en yüksek tamve en yüksek çözünürlüğe sahip olarak indirin.
Son toplama sonuçlarına tıklayıp indirebilirsiniz. MX basın P iş akışı ESRF ışın hattı Massive tarafından kullanılan tam otomatik olarak monte etmek, x-ışını ışın merkezi, karakterize, ve insan GCSH kristalleri bir dizi tam kırınım veri setleri toplamak. Örnekler monte edildi ve döngü tarayan bir alan için analiz edildi.
Kırınım analizlerinden sonra, veri toplama için kristal içinde dört nokta seçilmiştir. Moleküler replasman ile manuel yapı tayini, tek bir otomatik arıtma döngüsünden sonra yüksek kaliteli elektron yoğunluğu haritası nı ortaya koydu. Bu veri kümesi için, otomatik boru hattı bir noktada üç iki angstrom çözünürlüğü veri kesti.
Ancak, kullanıcılar verileri daha düşük çözünürlükte kesmeye karar verebilir. Sürekli elektron yoğunluğu eterminal histidin etiketi dışında tüm amino asit zinciri için görülebilir. İnsan ve büyükbaş hayvanı GCSH'yi ayıran dört ikameden üçü elektron yoğunluğunda kolayca tanımlanabilir.
Bu daha az aspartik asit lizin için daha az açıktır 125 ikame. Hangi yan zincirin elektron yoğunluğu sadece kısmen esneklik nedeniyle çözülür. Şu anda elde edilen model 20 nokta dört yüzde bir R çalışma değeri ve 23 nokta sekiz yüzde R serbest değeri ve daha otomatik ve manuel model oluşturma ve arıtma ek döngüleri ile optimize edilebilir.
Gereksinimleri sisteminize uyarlamak önemlidir. Örneğin, zaten gözlenen çözünürlüğü bilinen bir değere ayarlamak zamandan tasarruf edebilir ve daha iyi veri toplama sağlayabilir. Tam otomatik veri toplama kristalografi demokratikleştirilmiş ve şimdi bile küçük laboratuvarlar bu sadece büyük insan gücü ile daha önce mümkün iken ünlü proje girişmek olabilir.
Genel Bakış
Bu makale, protein kristalografisi için senkrotron ışın hatlarındaki otomatik tarama ve veri toplama sürecini açıklamaktadır. Tam otomatik sistem, araştırmacıların kriyojenik olarak soğutulmuş örneklerden insan müdahalesi olmaksızın verimli bir şekilde veri toplamasını ve işlemesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Protein kristalografisi
- X-ışını kırınımı
- Veri toplamada otomasyon
Arka Plan
- X-ışını kristalografisi, protein yapılarının belirlenmesi için temel öneme sahiptir.
- Zayıf kırınım yapan kristallerden veri elde etmek için senkrotron ışın hatları kritik rol oynar.
- Otomasyon, veri toplama verimliliğini ve kalitesini artırır.
- Massive one ışın hattı, biyolojik makromoleküller için tam otomatik bir iş akışı sunar.
Çalışmanın Amacı
- Sinkrotron ışın hatlarındaki otomatik veri toplama sürecini göstermek.
- Protein kristalografisinde otomasyonun avantajlarını vurgulamak.
- Araştırmacıların takip edebileceği ayrıntılı bir protokol sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Numunelerin yerleştirilmesi ve sinkrotrona gönderimi.
- Deney yönetimi için ISPyB bilgi sisteminin kullanımı.
- Otomatik veri toplama ve işleme iş akışları.
- Veri toplamanın gerçek zamanlı izlenmesi ve sonuçların analizi.
Ana Sonuçlar
- İnsan GCSH kristallerinden yüksek kaliteli difraksiyon verilerinin başarıyla toplanması.
- Otomatik işleme sonucunda yüksek çözünürlüklü bir elektron yoğunluğu haritası elde edildi.
- İnsan ve sığır GCSH arasındaki yapısal farklar belirlendi.
- Kristalografide otomatik iş akışlarının etkinliği kanıtlandı.
Sonuçlar
- Veri toplama süreçlerindeki otomasyon, kristalografiye erişimi demokratikleştirmektedir.
- Küçük laboratuvarlar artık önceden yalnızca daha büyük tesislere özgü olan karmaşık projeleri üstlenebilmektedir.
- Deneysel parametrelerin özelleştirilmesi, veri toplama verimliliğini artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Tam otomatikleştirilmiş sinkrotron ışın hatları, makromoleküler kristalografide manuel müdahaleyi azaltarak yüksek kapasiteli taramaya ve zayıf kırınım yapan kristallerden veri toplanmasına olanak tanır. Bu otomasyon, veri kalitesini ve kapasiteyi artırarak biyofarma Ar-Ge ekiplerinin bilimsel çabalarını ışın hattı operasyonlarından ziyade hedef doğrulamaya ve öncü bileşik optimizasyonuna ayırmalarını sağlar. Bu teknoloji, güvenilir 3D yapısal içgörüler aracılığıyla terapötik hedeflerin erken aşama risk azaltma süreçlerini destekleyerek yapısal biyolojiye erişimi demokratikleştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Biyolojik makromoleküller hakkında yüksek çözünürlüklü yapısal veriler sağlayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kristalizasyon denemelerinden elde edilen otomatik karakterizasyon ve veri toplama aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Yapı odaklı tasarım için tutarlı ve yüksek kaliteli elektron yoğunluğu haritaları sunarak hedef modellerine olan güveni artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Montaj, merkezleme ve difraksiyon analizlerini otomatikleştirerek alt akış işlemleri için valide edilmiş kristal sistemleri hazırlar.
- Operasyonel Değer: Önceden tanımlanmış iş akışları ve ISPyB üzerinden gerçek zamanlı izleme aracılığıyla analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Çok sayıda kristalin taranmasına ve otomatik boru hatlarının projeler genelinde yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Mekanistik çalışmalar için güvenilir modeller sağlayarak, keşif aşamasındaki yapısal verileri preklinik doğrulamaya bağlar.
- Riske Göre Düzenlenmiş İlerleme: İnsan ve sığır GCSH gibi tür varyantları arasındaki yapısal farklılıkları belirleyerek devam/dur kararlarını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Bağlanma bölgelerini ve esnekliği netleştirerek yapı-aktivite ilişkilerinin yorumlanmasına yardımcı olur.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Otomatik ışın hattı, erken hedef doğrulamadan lider bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre olarak, aşağı yönlü analizler ve modelleme için veri üretimine destek sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Proteinlerin ve komplekslerin kristal yapılarını çözerek hipotezlerin test edilmesini ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını kolaylaştırır.
- Tarama: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için çözünürlük, tamlık ve çokluk gibi nicel çıktılara sahip, analize hazır sistemler sunar.
- Analitik: Deneysel koşulları karşılaştırmak için R-work ve R-free değerleri, çözünürlük sınırları ve elektron yoğunluğu haritaları dahil olmak üzere ölçülebilir okumalar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: GCSH ile gösterildiği üzere, türe özgü model iyileştirmelerine olanak tanıyarak yapısal içgörüleri preklinik süreklilikle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef için yapısal tarama amacıyla yeniden kullanılabilir bir platform görevi görerek sahaya özgü uzmanlığa olan bağımlılığı azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef modellerde öngörü güveni, mekanistik belirsizliğin azaltılması ve yapı tabanlı ilaç tasarımı desteği.
- Operasyonel Değer: Örnekler ve projeler genelinde veri toplamanın standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: İyileştirilmiş devam/durdur kararları, azaltılmış hüzme hattı personeli sayesinde sermaye verimliliği ve öncü bileşik seçiminde düşürülmüş biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Yapısal güven ve veri kalitesi metriklerine dayalı olarak hedeflerin risk ayarlı önceliklendirilmesi.
Uygulama Hususları
- Kristallerin başarılı bir şekilde yerleştirilmesi ve karakterize edilmesi için protein kristalografisi ve numune hazırlama konusunda uzmanlık gereklidir.
- Otomatik veri toplama işlemi için senkrotron tesislerine ve Massive one hüzme hattı gibi enstrümantasyona erişim gereklidir.
- Ekipler arası standardizasyon; deney takibi, iş akışı seçimi ve sonuçların geri çağrılması için ISPyB'nin tutarlı kullanımını gerektirir.
- Model sistemler arası adaptasyon, kristal özelliklerine bağlı olarak çözünürlük eşikleri, uzay grubu ve radyasyon hassasiyeti gibi parametrelerin ayarlanmasını içerir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, kriyojenik olarak soğutulmuş numunelere duyulan ihtiyaç ve otomatik iş akışı başarı oranlarını etkileyen kristal kalitesine olan bağımlılık yer alır.
