Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

Metodumuz, türler arasındaki türler arasındaki genetik özellik farklılıklarının genetik temellerini türler içinde değil, genom ölçeğinde inceleyebilen ilk yöntemlerden biridir. Bu tekniğin başlıca avantajları, yüksek iş yapma, yüksek çözünürlük ve yaygın olarak uygulanabilir olmasıdır. Bu prosedüre başlamak için JR507 dondurucu stoku eksi 80 santigrat derecedeki depodan alın ve YPD agar plakası üzerindeki tek kolonilere doğru çizgi.

İki gün veya koloniler ortaya çıkana kadar 26 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra 100 mililitre likit YPD'yi 250 mililitrelik cam şişede TEK bir JR507 kolonisi ile aşılayın ve 200 RPM'de 24 saat veya sabit faza ulaşılAna kadar 28 santigrat derecede kuluçkaya yatın. Ertesi gün, gece kültürünün od600 ölçmek.

Geri yeni bir litrelik şişe içine taze sıvı YPD ile bir gecede kültür bazı seyreltmek sıfır noktası iki ve 500 mililitre lik hacmi bir od600 ile yeni bir kültür oluşturmak için. Tüm yeni kültürler için aynı gece kültürünü kullanarak, sıfır noktası iki od600 ile dört kültür toplam oluşturmak için bu işlemi üç kez daha tekrarlayın. 200 RPM'de sallayarak altı saat boyunca 28 santigrat derecede tüm kültürleri kuluçkaya yatırın.

Bundan sonra, bir litre kültür oluşturmak için 500 mililitrelik kültürlerin iki birleştirmek. İkinci bir litre kültür oluşturmak için kalan iki 500 mililitre kültür birleştirin. İlk olarak, her biri bir litre kültürden her birini toplam 40 tüp için plastik konik bir tüp içinde 20 50 mililitre likit aliquots'a bölün.

20 tüp ayırın. Kalan 20 tüpü 1000 kez G'de üç dakika boyunca maya hücrelerini peletleyin. Supernatant atın ve girdap tarafından steril su 25 mililitre ile her pelet resuspend.

Üç dakika için 1000 kez G santrifüj. Supernatant atın ve girdap tarafından 1X Tris-EDTA sıfır noktası bir Molar lityum asetat tampon beş mililitre ile her pelet resuspend. Üç dakika için 1000 kez G santrifüj.

Supernatant atın ve girdap tarafından beş mililitre 1X Tris-EDTA sıfır noktası bir Molar lityum asetat tampon ile tekrar her pelet askıya. Üç dakika için 1000 kez G santrifüj. Hücreler santrifüj ederken, polietilen glikol, lityum asetat ve Tris-EDTA tampon içeren bir çözeltinin en az 120 mililitre hazırlamak.

Bu çözeltiyi buzüzerinde saklayın. Plazma DNA'sını dönüşüme hazırlamak için, ilk olarak dört mililitre somon spermi DNA'sını 100 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Bundan sonra, hemen beş dakika buz üzerinde soğutun.

20 mililitre pJR487'yi mililitrede 538 nanogramlık bir konsantrasyonla ve dört mililitre soğuk somon sperm DNA'sını karıştırın. Kullanıma hazır olana kadar bu karışımı buz üzerinde tutun. Daha sonra, her hücre pelet üstüne plazma ve sperm DNA karışımı 600 mikrolitre ekleyin.

Her pelet için PEG lityum asetat TE karışımı üç mililitre ekleyin. Biz yukarı ve aşağı borulama ve sonra girdap tarafından askıya. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.

Sonra 26 dakika boyunca 39 santigrat derece bir su banyosunda her tüp ısı şoku, her tüp ters emin olun birkaç dakika. Tüpleri 1000 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve girdap tarafından YPD 10 mililitre her pelet resuspend.

Bundan sonra, yeni bir cam şişe içine tüm 20 tüpleri birleştirin. Yeni bir litrecam şişe içine sıvı YPD 433 nokta dört mililitre ekleyin. Sonra 66 nokta altı mililitre hücreyi şişeye aktarın.

Dönüştürülmüş hücrelerin tüm hacmini kullanmak için bu aktarım işlemini iki kez daha yineleyin. Sonra her yeni 500 mililitrelik kültürün od600 ölçün. 200 RPM'de sallayarak iki saat boyunca 28 santigrat derecede her üç kültürü kuluçkaya yatırın.

Bundan sonra mililitre başına 300 mikrogram lık bir son konsantrasyona g418 başına 5 mililitre lik bir ağırlık ekleyin. Şişeleri 28 santigrat derece ve 200 RPM'de sallanan kuvöze geri ver. Kalan 20 konik tüpler ile tüm bu süreci tekrarlayın.

Bu noktada, g418 ile hücrelerin her biri 500 mililitre içeren altı bir litre şişeler olmalıdır. Yaklaşık iki gün boyunca 200 RPM sallayarak 28 santigrat derece tüm altı şişe kuluçka ya da yaklaşık iki nokta üç bir od600 her şişe ulaşılır kadar. Daha sonra, tek bir kültür oluşturmak için birlikte altı şişeleri birleştirin.

Bu kombine kültürü kullanarak 500 mililitre YPD ve G418 ile sıfır noktası iki od600'e iki yeni litrelik şişeyi aşılamak için kullanın. Bu yeni kültürleri bir gecede 28 santigrat derecede 200 RPM'de sallayarak, yaklaşık iki nokta iki od600'e ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, tek bir kültür içine her iki kültürü birleştirmek ve kombine kültürün od600 ölçmek.

Üç dakika boyunca 1000 kez G bu kültürün santrifüj 25 mililitre. Metin protokolünde belirtildiği gibi 25 mililitredeki toplam od600 hücre birim sayısını hesaplayın. Supernatant atın ve mililitre başına sekiz beş bir nokta bir od600 ile bir hücre süspansiyon oluşturmak için yeterli su hücreleri yeniden askıya.

Cam boncuklar kullanarak, 5-FOA ile 12 büyük, kare tam sentetik agar plakaları her üzerine resuspended hücrelerin bir mililitre plaka. Her plakayı 1-2 gün veya tabakta bir çim oluşturana kadar 28 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, küçük steril squeegees plaka nın yarısı hücreleri hurda ve bir tüp içine, steril su 35 mililitre içeren kullanın.

Kalan altı plaka için bu işlemi tekrarlayın, suda iki hücre tüpleri sonuçlanan. Hücre süspansiyonlarını tek bir şişede birleştirin ve boş olarak su kullanarak süspansiyonun od600'ini ölçün. Od600 mililitre başına 44 nokta dört ulaşana kadar hücre konsantrasyonu ayarlamak için su kullanın.

Daha sonra, hücre dondurucu stokları hazırlamak ve eksi 80 derece santigrat metin protokolünde belirtildiği gibi saklayın. Bu çalışmada, S.Cerevisiae ve S.Paradoxus mutagenez transpoze tabi steril bir melez oluşturmak için çiftleştirilmiştir. Her mutajenize klonu bir hemizygot, bir genin bir alel bozulur bir diploid melez.

Hemizygotlar yüksek sıcaklıkta yarışılır ve DNA her kültürden izole edilir. DNA şirk ve adaptörlere bağlı, ve transposon ve genom arasındaki kavşak bir transposon özgü astar ve adaptör özgü astar ile yükseltilir. Amplicon gelen toplu sıralama okuma sayıları sayma, nüfus içinde bir klonik uygunluk rapor.

Bu sıralama elde sonuçları ile, belirli bir gen için hemizygot bolluk, hemizygotes iki sınıf arasında iki sıcaklıkta karşılaştırılabilir. Sadece S.Cerevisiae alelinin vahşi tip ve fonksiyonel olduğu klonlar ve sadece S.Paradoxus aleline güvenen klonlar. Bu temsili uygulamada, sekiz temizlik geninde güçlü sinyaller tespit edilir.

Her durumda, melez S.Cerevisiae alel transposon eklemeler, yüksek sıcaklıkta büyüme tehlikeye. Bu düşük si, S.Cerevisiae'yi S.Paradoxus'tan ayıran termotolerans özelliğinin aday belirleyicilerini temsil ediyor. Bu deneyi tamamladığımızda, bu türler arasında farklılık gösteren soğuk veya tuz toleransı gibi diğer özellikleri de inceleyebiliriz.