Sitofast ve Upstream Kümeleme Yöntemleri FlowSOM ve Cytosplore kullanılarak Yüksek Boyutlu Sitometri Verilerinin Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi
12 Aralık 2019
Cytofast kümeleme çıktıanaliz etmek için kullanılan bir görselleştirme aracıdır. Sitofast iki kümeleme yöntemini karşılaştırmak için kullanılabilir: FlowSOM ve Cytosplore. Sitofast hızla kütle sitometri verilerinin nicel ve nitel bir genel bakış oluşturabilir ve farklı kümeleme algoritmaları arasındaki temel farkları vurgulayabilir.
Kitle sitometrisi tarafından üretilen veriler karmaşıktır ve verimli ve basit bir şekilde görselleştirilmesi gerekir. Sitofast, immün hücre popülasyonu içindeki immünolojik örüntüleri vurgulayan ve klinik tedavilere veya deneysel gruplara bağlı hücre alt kümelerini belirleyen bir yöntemdir. Sitofast FlowSOM veya Cytosplore gibi herhangi bir kristalize yöntemden sonra uygulanabilir.
Bu klinik tedavi veya deneysel bir grup ile bağlantılı bir hücre alt kümesi keşfetmek için izin verecektir. Bu yöntemle, verilerin immünolojik genel görünümünü bir bakışta nicel bir şekilde görebileceksiniz. Cytosplore veya FlowSOM ile kümeler oluşturarak başlayın.
Cytosplore kullanıyorsanız, Dosyalar'ı tıklatarak FCS dosyalarını yükleyin ve FCS dosyalarını açın. Ardından, istendiğinde Hiperbolik ArcSinh dönüşümü için bir kofaktör seçin ve kanal olarak benzersiz örnek etiketi ekle'ye tıklayın. Üç HSNE düzeyini çalıştırmak ve haritanın oluşturulmasını beklemek için HSNE çalıştır'ı seçin.
İlk HSNE düzeyinde, CD161 pozitif hücreleri seçerek ve seçime sağ tıklayarak CD161 için pozitif olan hücreleri kontrol edin. İkinci düzeyde, yalnızca CD161 olumlu olaylar ile üçüncü seviyeye ulaşmak için prosedürü tekrarlayın. Son TSNE haritası oluşturulduktan sonra, haritaya sağ tıklayarak ve kaydetme kümelerini seçerek Cytosplore tarafından tanımlanan kümeleri kaydedin.
Cytosplore tarafından istendiği gibi çıktı dosyalarının dizinini seçin ve bu konumu not alın, çünkü daha sonra FSC dosyalarını R.'a yüklemek için kullanılacaktır, çünkü daha sonra basit bir karakter yalnızca çıkış dosyalarını yeniden adlandırırken kimlik ve daha fazla işleme yi ve kaydetmeyi seçin. Belirlenen fonksiyon readcytosploreFCS ile dosyaları R'ye yükleyin. Verileri temizlemek için, gereksiz parametrelerle ilgili sütunun konumunu kontrol ederek ve matristen kaldırarak zaman ve arka plan gibi bazı parametreleri kaldırın.
Ardından, soy işaretçilerinin önce işlevsel işaretçiler tarafından görüntülenmesi için işaretçileri yeniden sırala. Klinik bilgileri içeren elektronik tablo metadosyasını yükleyerek meta veri dosyasını Cytosplore'dan oluşturulan verilere bağlayın. FlowSOM ile kümeleme gerçekleştirmek için, daha önce CD161 pozitif olaylar üzerinde daha önce kapılı ham verileri okumak ile yükleyin.
flowSet fonksiyonu. Uygun sütunları seçerek ve verileri ArcSinh5 şekilde dönüştürerek ilgili biyolojik belirteçleri seçin. İşlevde kofacter=5 seçerek beş kofaktör uygulayın.
FlowSOM işlevini kullanarak verileri kümele ve daha önce Cytosplore tarafından verilen çıktıyla aynı 10 alt kümede verileri kümelemeyi seçerek FlwoSOM ve Cytosplore'u karşılaştırın. Daha sonra her hücreyi tanımlanan alt kümesine ve örnek ID'ye atayın.Grup atamasını içeren R meta veri dosyasını yükleyin ve metin el yazmasındaki kodu kullanarak FCS dosyalarına bağlayın. FlowSOM'dan elde edilen veri çerçevesini temel alan bir CF listesi oluşturun.
Ardından işaretçilerin Cytosplore çözümlemesi çıktısına benzer şekilde görünmesini yeniden sıralayın. Isı eşlemlerini oluşturmadan önce, hücre Sayısı işlevini kullanarak örnek başına sayım tablosunu oluşturun. Bazı kümeler diğerlerinden daha az hücre içerdiğinden, ölçek=gerçek işlevi içinde belirterek küme başına verileri ölçeklendirin, bu da örnekler arasındaki dağılımları görmeyi kolaylaştırır.
Verileri bir ısı haritasıyla görselleştirin ve hücre sayısını oluşturarak ancak her kümenin sıklığını elde etmek için verileri ölçeklendirmeyerek kutu çizimleriyle görselleştirin. Son olarak, CD45, CD11c ve CD54 işaretçilerin ifade yoğunluğunu belirteç adlarına göre görselleştirin ve bunları MSI çizim işlevine dahil edin. Sitofast, analizde tanımlanan ve işaretleyici ifadesine dayanan tüm kümelerin ısı haritası da dahil olmak üzere birçok olası çıktı çalıştırAr.
Üstteki dendrogram, tanımlanan kümeler arasındaki hiyerarşik benzerliği temsil eder. Üst panel, her örnekteki karşılık gelen alt kümelerin göreli miktarını gösteren başka bir ısı haritası görüntüler. Bu arada, sağdaki dendrogram, doğal öldürücü hücrelerin fenotipinin enjeksiyondan üç gün sonra PD-L1 tedavisi ile şekillendirdiğini gösteren alt küme frekanslarına dayalı örnekler arasındaki benzerliği göstermektedir.
Kombine ısı haritaları FlowSOM ve Cytofast ve Cytosplore ve Cytofast için elde edilebilir. Sitofast, verileri nicel olarak sunmak ve sonuçları kutu çizimlerinde görüntülemek için de kullanılabilir. Cytofast paketinde yer alan bir diğer özellik, grup başına her işaretçinin ortanca sinyal yoğunluğu çizimini gösteren MSI çizim işlevidir.
Bu işlev, PD-L1 tedavi edilen grubun doğal öldürücü hücrelerinde CD54 veya CD11c ekspresyonundaki artışlar gibi genel değişikliklerin algılanmasını sağlar. Bu teknik verileri görselleştirmek ve ölçmek için hızlı bir yoldur ve tedaviden sonra yeni hücresel yanıtları keşfetmek için kullanılabilir. Bu yöntemden sonra, R'deki genel test paketi yanıt değişkenleri ile ilişkilendirmek için bir grup covariates'i test etmek için kullanılabilir.
Bu, her alt küme ile klinik sonuç arasındaki korelasyonu gösterir.
Genel Bakış
Cytofast, FlowSOM ve Cytosplore gibi kümeleme yöntemlerini karşılaştırarak kütle sitometri verilerini analiz etmek için tasarlanmış bir görselleştirme aracıdır. Kümeleme algoritmaları arasındaki farkları vurgulayarak, verilerin hızlı bir nicel ve nitel genel görünümünü sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kütle sitometrisi
- Veri görselleştirme
- Kümeleme analizi
Arkaplan
- Kütle sitometrisi, etkili görselleştirme gerektiren karmaşık veriler üretir.
- Cytofast, bağışıklık hücresi popülasyonları içindeki immünolojik paternleri tanımlar.
- FlowSOM veya Cytosplore gibi kümeleme yöntemlerinden sonra uygulanabilir.
- Klinik tedavilerle bağlantılı hücre alt kümelerini anlamak, araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Kütle sitometri verilerinin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için bir araç sağlamak.
- Farklı kümeleme yöntemlerini etkili bir şekilde karşılaştırmak.
- Klinik sonuçlarla ilişkili hücre alt kümelerinin keşfini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kümeler Cytosplore veya FlowSOM kullanılarak oluşturulur.
- Veriler, analiz için R ortamında dönüştürülür ve temizlenir.
- Kümeleme gerçekleştirilir ve sonuçlar ısı haritaları ile kutu grafikleri aracılığıyla görselleştirilir.
- Marker ekspresyonundaki genel değişiklikleri tespit etmek için MSI plot fonksiyonu kullanılır.
Temel Sonuçlar
- Cytofast, kümeleme sonuçlarını göstermek için ısı haritaları ve dendrogramlar oluşturur.
- Doğal öldürücü hücre fenotipleri üzerinde tedavilerin etkisini vurgular.
- Kantitatif sonuçlar, kutu grafikleri ve MSI grafikleri aracılığıyla sunulur.
- Araç, hücresel yanıtların hızlı bir şekilde görselleştirilmesine ve nicelendirilmesine olanak tanır.
Sonuçlar
- Cytofast, kütle sitometri verilerini analiz etmek için etkili bir araçtır.
- Tedavilerle ilişkili olarak bağışıklık hücresi alt kümelerinin anlaşılmasını geliştirir.
- Yöntem, terapi sonrası yeni hücresel yanıtların keşfedilmesini destekler.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Uyumluluğu
Kütle sitometrisi, immünoterapi geliştirmedeki hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerini desteklemek için hızlı görselleştirme ve nicelendirme gerektiren yüksek boyutlu immün profilleme verileri üretir. Cytofast, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin FlowSOM ve Cytosplore'dan elde edilen kümeleme çıktılarını karşılaştırmalarına olanak tanıyarak, PD-L1 blokajına karşı immün hücre alt küme yanıtlarının hipotez testlerini kolaylaştırır. Bu durum, NK hücre aktivasyonunun ve tümör mikroçevresindeki fenotipik değişimlerin nicel, tekrarlanabilir okumalarını sağlayarak go/no-go (devam/tamam) kararlarını hızlandırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İmmün hücre alt kümelerini klinik tedavilerle veya deneysel gruplarla ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Farklı koşullar arasında küme bolluğunun ve marker ekspresyonunun kantitatif karşılaştırması yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörü Güvenilirliği: CD54 ve CD11c gibi NK hücre aktivasyon markerlarındaki PD-L1 kaynaklı değişiklikleri görselleştirerek hedef mekanizmalara olan güveni artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik taraması ve biyobelirteç değerlendirmesi gibi sonraki süreçler için kümeleme çıktılarından valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Tekrarlanabilirlik: Deneyler arasında tutarlı girdiler sağlamak için veri dönüştürme ve temizleme adımlarını (örneğin, ArcSinh dönüşümü, parametre kaldırma) standartlaştırır.
- Ölçeklenebilirlik: Isı haritaları, kutu grafikleri ve MSI grafikleri için otomatik R tabanlı iş akışları aracılığıyla platformun birden fazla örnek ve koşulda yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgisi: Tümör mikroçevresindeki immün modülasyonu, özellikle immünoterapiye karşı NK hücre yanıtlarını modelleyerek translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Preklinik Süreklilik: In vivo çalışmalar öncesinde immün alt grup frekanslarını ve fonksiyonel durumları nicelendirerek, keşif aşaması ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Terapötik yanıtla ilişkili, tekrarlanabilir immünolojik paternleri tanımlayarak devam/dur kararlarına veri sağlar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Cytofast; erken dönem immün profillemeden ön aday belirlemeye ve preklinik doğrulamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre olarak, immünoterapi adaylarının veri odaklı ilerlemesini sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Deneysel gruplarla veya klinik sonuçlarla ilişkili hücre alt kümelerini tanımlayarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Güvenilir bileşik veya modülatör değerlendirmesi için analize hazır, tekrarlanabilir kantitatif çıktılar (örneğin, ölçeklendirilmiş küme frekansları) sunar.
- Analitik: Markör ekspresyon yoğunluğunu ve alt küme dağılımını nicelendiren MSI grafikleri ve ısı haritaları sağlayarak koşullar arası karşılaştırmalara olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: NK hücresi aktivasyon durumlarını immünoterapi mekanizmalarıyla ilişkilendirerek immün fenotiplemeyi preklinik süreklilikle bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla immünoterapi projesi ve immün izleme kampanyası genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir analitik modül olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kontrol noktası blokajına verilen bağışıklık yanıtlarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Betik tabanlı R iş akışları ve tutarlı ön işleme adımları aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Kantitatif bağışıklık profillemesi yoluyla immünoterapi hedeflerinin erken aşamada riskten arındırılmasını sağlayarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: İlerleme kararlarına yön veren yanıtların immünolojik imzalarını tanımlayarak, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Kütle sitometri veri analizi, R programlama ve kümeleme yorumlama (FlowSOM, Cytosplore, HSNE/t-SNE) konularında uzmanlık gerektirir.
- CyTOF veri kazanımı için kullanılan enstrümantasyona ve R tabanlı işleme ve görselleştirme için hesaplama altyapısına bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için kapılama stratejilerinin, marker panellerinin ve meta veri açıklama işleminin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- İş akışlarının NK hücreleri ve PD-L1 blokajı dışındaki farklı immün hücre tiplerine, hastalık modellerine veya terapötik modalitelere uygulanması durumunda adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Üst akış kümeleme kalitesi ve Cytosplore ile FlowSOM adımlarında parametrelerin (örneğin kofaktör, küme sayısı) manuel optimizasyon ihtiyacı ile sınırlıdır.
